一种高效的人类血液免疫细胞CD4T分离培养技术制造技术

本发明专利技术公开了一种高效的人类血液免疫细胞CD4T分离培养技术，所述CD4T分离培养包括人类血液中的单个核细胞免疫细胞的分离方法和人类血液中的单个核细胞的体外培养扩增方法两部分，本发明专利技术具有提高工作效率，节约工作时间，免疫细胞群收获率高，使用方便，耗材便宜，自血样注入采血管、血清分离、血样保存，废弃物处理的全过程都在同一支管中进行，避免血样沾污操作者，防止血液中病毒的感染，减少了医疗废物，提高了工作效率。提高了工作效率。提高了工作效率。

【技术实现步骤摘要】
一种高效的人类血液免疫细胞CD4T分离培养技术


[0001]本专利技术涉及一种培养技术，特别涉及一种高效的人类血液免疫细胞CD4T分离培养技术，属于生物细胞体外免疫细胞分离培养


技术介绍

[0002]免疫细胞(immune cell)俗称白细胞，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛，主要是T淋巴细胞、B淋巴细胞受抗原刺激而被活化(activation)，分裂增殖、发生特异性免疫应答。除T淋巴细胞和B淋巴细胞外，还有K淋巴细胞和NK淋巴细胞，共四种类型。T淋巴细胞是一个多功能的细胞群。除淋巴细胞外，参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单核吞噬细胞系统的细胞，这些免疫细胞主要在我们的血液当中，当我们身体那个器官出现问题时血液就会把这些免疫细胞送到出现问题的部位进行战斗，进而清除进入身体的细菌和病毒，保护了我们身体里的细胞和器官。当我们身体里免疫细胞群数量缺少时就不能及时的清除外来入侵的细菌和病毒和自身变异的细胞，这时我们的身体就会出现个总疾病，比如乙肝(HBV)患者，癌症，这些疾病都是和免疫细胞有直接的关系。
[0003]高效的从外周中分离出免疫细胞群，在体外培养扩增，扩增到一定数量后进行临床应用或冻存，这个过程中就有一个人技术难点，这个技术难点主要是先获取外周血里足够的免疫细胞种子，在进行体外培养扩增。现在操作是抽取患者50ml外周血，用T淋巴细胞分离液进行分离血液中的T淋巴细胞，获得后在进行体外后续的培养扩增。培养的周期长短用的培养试剂的多少，都与种子细胞获得的多少有直接的关系。本专利技术大大提高了外周血中收获更多的免疫细胞群的元代种子细胞数量，以及改变培养方法，缩短培养周期，大大提高体外免疫细胞的活性，数量的关键问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种高效的人类血液免疫细胞CD4T分离培养技术，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种高效的人类血液免疫细胞CD4T分离培养技术，所述CD4T分离培养包括人类血液中的单个核细胞免疫细胞的分离方法和人类血液中的单个核细胞的体外培养扩增方法两部分，具体内容如下：
[0006]第一：制作分离血液的器械，分离血液的器械有三部分组成，一是离心管，二是抗凝血剂，三是分离胶，免疫细胞分离胶是一种疏水性的有机化合物，其作用原理是：一般血清比重约1.02，红细胞比重为：1.093，多形核白细胞比重：1.092，血小板比重约为：1.032，单个核细胞比重为：1.076
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1.090，分离胶比重维持在1.77，在离心力的作用下，免疫细胞分离胶在血清、白细胞和红细胞间形成隔离层，把5ml分离胶置于50ml离心管底部，依次加入聚烯烃、聚酯和丙烯加入到离心管，进行离心3500r/min，离心15分钟，制备成带有免疫细胞
分离胶的离心管备用；
[0007]第二：用50ml注射器抽取2.0ml肝素抗凝剂，注射器推拉几次让肝素湿润注射器管壁，换新的注射器针头，抽取外周静脉自体血40ml，将40ml抗凝全血置于50ml分离胶的离心管中，配平上离心机，3500r/min，离心15分钟，得到分离胶即在血清、白细胞和红细胞之间形成隔离层，并使血清保持原状，无改变，隔离层紧密地粘附在试管璧上，避免了纤维蛋白和溶血的影响，分离胶上面粘附一个白膜层，此白膜层就是目标细胞层；
[0008]第三：取出离心管，弃上清至中间层，预留15ml血浆，用吸管轻轻反复吹打血浆到免疫细胞分离胶表面，把分离胶上的白色膜完全吹散在血浆中，把吹打好的血浆置入到新的离心管中，进行清洗，1
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2次，把分离好的细胞移入50ml离心管中加入盐水30ml，用吸管进行吹打，吹打后，上离心机配平，放入离心机中离心2200r/min转20min；
[0009]第四：免疫细胞培养液的配比，A瓶的免疫细胞培养基1000ml中加入8％胎牛血清，加入白介素2两瓶200万U，加入胸腺五肽10mg，加入干扰素a2b1m500万U，培养12天加入B瓶免疫细胞培养液：免疫细胞培养基1000ml中加入8％胎牛血清，加入白介素2两瓶200万U，加入胸腺五肽10mg，加入干扰素a2b 1m500万U，加入卡介苗0.25g；
[0010]第五：取出离心管，去上清后，留下沉淀，在往沉淀组织里加入A瓶免疫细胞培养液20ml，用巴士滴管反复吹打完全吹散沉淀物，吹散后，移植到T82细胞培养瓶中，在把T82细胞培养瓶放入5％CO2的培养箱中进行培养，第三天往T82瓶中加入50mlA瓶免疫细胞培养基，第六天把T82细胞瓶中的细胞到入细胞袋中培养，同时加入100mlA瓶细胞培养液，第九天在往免疫细胞袋中加入150mlA瓶免疫细胞培养液，第十二天在往免疫细胞袋中加入B瓶免疫细胞培养液。三天后补充细胞培养液，在免疫细胞培养15天后免疫细胞数量能达到1.6*1010细胞；
[0011]第六：把细胞袋里培养完成后置入500ml锥形离心瓶中，配平离心2600r/min转15min，离心完成后，弃上清，弃上清后在往离心瓶中加入40ml0.9％氯化钠用巴士滴管进行吹打，把瓶底细胞沉淀完全吹散在氯化钠溶液中，配平放入离心机2600r/min转15min，离心后两个500ml离心瓶去上清，每瓶离心瓶中加入20ml0.9％氯化钠溶液悬浮细胞，备用。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0013]1.本专利技术一种高效的人类血液免疫细胞CD4T分离培养技术，本专利技术具有提高工作效率，节约工作时间，免疫细胞群收获率高，使用方便，耗材便宜，自血样注入采血管、血清分离、血样保存，废弃物处理的全过程都在同一支管中进行，避免血样沾污操作者，防止血液中病毒的感染，减少了医疗废物，提高了工作效率。
附图说明
[0014]图1为本专利技术五分类血细胞检测仪检测表格示；
[0015]图2为本专利技术分离胶提取单个核细胞与T淋巴细胞分离液提取做对比表格；
[0016]图3为本专利技术流式细胞仪检测细胞扩增前后CD4、CD56+CIK、NK、NKT、细胞比例示意图。
具体实施方式
[0017]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0018]请参阅图1
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3，本专利技术提供了一种高效的人类血液免疫细胞CD4T分离培养技术的技术方案：
[0019]一种高效的人类血液免疫细胞CD4T分离培养技术，其特征在于，所述CD4T分离培养包括人类血液中的单个核细胞免疫细胞的分离方法和人类血液中的单个核细胞的体外培养扩增方法两部分，具体内容如下：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效的人类血液免疫细胞CD4T分离培养技术，其特征在于，所述CD4T分离培养包括人类血液中的单个核细胞免疫细胞的分离方法和人类血液中的单个核细胞的体外培养扩增方法两部分，具体内容如下：第一：制作分离血液的器械，分离血液的器械有三部分组成，一是离心管，二是抗凝血剂，三是分离胶，免疫细胞分离胶是一种疏水性的有机化合物，其作用原理是：一般血清比重约1.02，红细胞比重为：1.093，多形核白细胞比重：1.092，血小板比重约为：1.032，单个核细胞比重为：1.076
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1.090，分离胶比重维持在1.77，在离心力的作用下，免疫细胞分离胶在血清、白细胞和红细胞间形成隔离层，把5ml分离胶置于50ml离心管底部，依次加入聚烯烃、聚酯和丙烯加入到离心管，进行离心3500r/min，离心15分钟，制备成带有免疫细胞分离胶的离心管备用；第二：用50ml注射器抽取2.0ml肝素抗凝剂，注射器推拉几次让肝素湿润注射器管壁，换新的注射器针头，抽取外周静脉自体血40ml，将40ml抗凝全血置于50ml分离胶的离心管中，配平上离心机，3500r/min，离心15分钟，得到分离胶即在血清、白细胞和红细胞之间形成隔离层，并使血清保持原状，无改变，隔离层紧密地粘附在试管璧上，避免了纤维蛋白和溶血的影响，分离胶上面粘附一个白膜层，此白膜层就是目标细胞层；第三：取出离心管，弃上清至中间层，预留15ml血浆，用吸管轻轻反复吹打血浆到免疫细胞分离胶表面，把分离胶上的白色膜完全吹散在血浆中，把吹打好的血浆置入到新的离心管中，进行清洗，1
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【专利技术属性】
技术研发人员：王臣，
申请(专利权)人：吉林省真承药业有限公司，
类型：发明
国别省市：