一种人脐带间充质干细胞诱导分化为成纤维细胞组合应用技术制造技术

本发明专利技术一种人脐带间充质干细胞诱导分化为成纤维细胞组合应用技术，通过体外培养脐带间充质干细胞定向诱导分化为成纤维细胞，在移植皮肤组织时加入透明质酸钠以固定细胞定植防止游走，同时加入脐带间充质干细胞外泌体进行多肽蛋白信号的传递，活化自体血CGF血清做为脐带间充质干细胞营养刺激增殖扩增液，所述的配方组合保证脐带间充质干细胞移植到皮肤组织里有充足的蛋白营养，帮助间充质干细胞在皮肤组织内定植、增殖、更新诱导分化为功能型细胞增加皮肤组织中胶原蛋白含量，改善面部皮肤组织年青化进程，抵抗岁月衰老，应用本发明专利技术可以达到面部皮肤年轻化的目的，对面部皮肤组织皱纹淡化，肌肤紧致、光老化修复、亮肤美白。亮肤美白。亮肤美白。

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带间充质干细胞诱导分化为成纤维细胞组合应用技术


[0001]本专利技术涉及一种干细胞诱导分化为成纤维细胞的组合应用技术，特别涉及一种人脐带间充质干细胞诱导分化为成纤维细胞组合应用技术，属于生物干细胞细胞分离培养


技术介绍

[0002]脐带间充质干细胞，是一类其有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的原始细胞群体，是可以分化成各种组织器官的祖细胞，成骨、成软骨、成脂，它具有自我更新、分化潜能、低免疫原性和良好的组织融合性等特点，被医学界称为“多能干细胞”，在全球干细胞总市场中，脐带干细胞培养，应用，占据着90％的份额，整体来看，干细胞技术的应用前景广阔，脐带间充质干细胞作为干细胞最重要的一员。脐带是生产后废弃物，无医学伦理的限制，脐带可以存储，破碎后分离脐带干细胞培养。
[0003]脐带间充质干细胞培养及存储都是比较成熟的技术，现在有的常规培养技术，把培养好的脐带间充质直接用于临床，在大部分临床慢性病中应用效果良好，但在面部皮肤组织抗衰老年轻化中应用脐带间充质干细胞时，不能达到抗衰老的结果。现在有细胞培养应用技术还不能满足临床上要求。而且对面部皱纹，纹理，色素沉着，黄褐斑，皮肤紧致等面部明显衰老的特征，基本无效。应用本专利技术可以达到面部皮肤年轻化的目的，对面部皮肤组织皱纹淡化，肌肤紧致、光老化修复、亮肤美白，色素黄褐斑的淡化都有明显的作用和效果，为美容整形爱美人士提供新技术产品。
[0004]间充质干细胞对面部皮肤组织无效的主要原因有三项：1.是面部皮下组织微循环血管发达，血运丰富，大部分间充质干细胞进入皮下组织后随着血运循环进行游走，大部分干细胞没有充足的时间定植归巢在皮肤组织里。
[0005]间充质干细胞到达皮肤组织里需要诱导分化为成纤维细胞，成纤维细胞才能发挥其细胞功能性，才能分泌生产各种纤维束，如Ⅰ型胶原Ⅲ型胶原蛋白和弹力纤维，透明质酸等抗皮肤衰老蛋白物质，这些抗皮肤衰老蛋白物质才能使皮肤组织年轻化，抵抗衰老，现有的间充质干细胞移植到皮肤组织里后，大部分细胞没有被诱导分化为成纤维细胞，因为间充质干细胞有多项分化的潜能，到达皮质组织里后能够分化多种功能性细胞，没有专一性，所以没有明显效果和作用。
[0006]间充质干细胞进入皮质组织后，没有很好营养供给也会影响间充质干细胞的归巢性，增殖能力和诱导分化能力，外泌体蛋白信号分泌不足，导致脐带间充质干细胞自我更新增殖分化能力减弱，细胞衰老。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种人脐带间充质干细胞诱导分化为成纤维细胞组合应用技术，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种人脐带间充质干细胞诱导分化为成纤维细胞组合应用技术，包括以下内容：
[0009]S1：P1代脐带间充质干细胞2
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106接种于T85细胞培养瓶中，加入定向诱导分化为成纤维细胞完全培养基20mlDMEM
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F12培养液，进行成纤维细胞诱导，每天显微镜下观察，第三天细胞密度大于80％时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，一瓶细胞分三瓶细胞传P2代；
[0010]S2：P2代脐带间充质干细胞2
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106接种于T85细胞培养瓶中，加入定向诱导分化为成纤维细胞完全培养基20mlDMEM
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F12培养液(含9％FBS，1000u/ml庆大霉素，100u/ml链霉素、重组人碱性成纤维细胞生长因子300u/ml、低分子肝素5u/ml、人表皮生长因子10u/ml0.5mg/ml脯氨酸)进行成纤维细胞诱导,置于37℃，5％的CO2培养箱培养，每天显微镜下观察，第三天细胞密度大于80％时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，3瓶细胞分9瓶细胞传P3代。
[0011]S3：P3代脐带间充质干细胞，置于37℃，5％的CO2培养箱培养，培养三天后用定向诱导分化为成纤维细胞完全培养基培养细胞至80％一90％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化1瓶脐带间充质干细胞，上流式细胞仪检测细胞表面标志物，诱导细胞向成纤维细胞分化，免疫组织化学检测I型胶原的表达，脐带间充质干细胞诱导成纤维细胞完成。用0.25％胰蛋白酶消化P3代脐带间充质干细胞诱导成纤维细胞9瓶。收获脐带间充质干细胞诱导的成纤维细胞4
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107数量，置入50ml离心管中用0.9％生理盐水进行吹打清洗，配平上离心机3000转10分钟，弃上清，细胞沉淀于瓶底用生理盐水悬浮，清洗两遍。
[0012]取出离心管去上清，在用3ml浓缩的脐带间充质干细胞外泌体液重新悬浮间充质诱导分化的成纤维细胞4
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107吹散，过200目细胞筛，备用。
[0013]S4：收集P1
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P3阶段的脐带间充质干细胞培养过程的换下来的废液，加入5％医用活性炭进行吸附酚红和内毒素，轻轻摇晃5分钟，室温下放置2个小时，置于50ml注射器中，注射器出药口装上0.22um一次性针头过滤器，过滤出活性炭，把过滤出来的液体分别装到15ml离心管中，把装完干细胞废液的离心管放入到超速离心机中，用电子天平配平后，5万转离心2小时，去上清至瓶内1ml处，把瓶底沉淀吹散在1ml溶液中，此时液体为间充质干细胞外泌体，收集3只15ml离心管间充质干细胞外泌体共计3ml溶液，用于悬浮脐带间充质干细胞；
[0014]S5：CGF采集管抽取移植者静脉外周血4管，收集全血30ml，四个CGF采集管离心15分钟，3500r/min，弃上清至分离胶上2ml处，用巴氏滴管吹打分离胶上剩下的上清液，吹打分离胶表面白膜层，将分离胶表面上黏附的白膜层完全吹散在血清当中，使其清澈的血清变的浑浊，再将4瓶浑浊的血浆收集到一个15ml离心管中，在将装有富血小板、白细胞、单个核细胞的血浆的15ml离心管，上离心机3700/min，15分钟，取出15ml离心管弃上清至到3ml处，保留3ml浓缩的自体血清，用吸管把15ml离心管瓶底沉淀物吹散在3ml血清中，并进行活化处理，活化后CGF血清做为脐带间充质干细胞营养刺激增殖扩增液，保证脐带间充质干细胞移植到皮肤组织里有充足的蛋白营养；
[0015]S6：将自体血CGF加入到间充质干细胞诱导的成纤维细胞瓶中，与成纤维细胞、间充质干细胞外泌体、三者用滴管轻轻吹打混匀，在将混合好的的细胞液抽到20ml注射中，注射器出药口装上两通连接器，再将装有2.5ml透明质酸钠注射器连接到两通上，将2.5ml透明质酸钠推注到20ml注射器中，拔掉两通上的2.5ml注射器，两通上装上新的20ml注射器，
将混合在一起的成纤维细胞液在两个20ml注射里来回推动数下，让溶液完全混匀，拔掉一个空的20ml注射器，用小白帽封口。
[0016]通过以上操作，制备出8.5ml(4
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107)成纤维面部皮肤脐带间充质干细胞诱导分化的成纤维细胞组合混合注射液。
[0017]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述DMEM
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F12培养液含9％FBS，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞诱导分化为成纤维细胞组合应用技术，其特征在于，包括以下内容：S1：P1代脐带间充质干细胞2
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106接种于T85细胞培养瓶中，加入定向诱导分化为成纤维细胞完全培养基20ml DMEM
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F12培养液，进行成纤维细胞诱导，每天显微镜下观察，第三天细胞密度大于80％时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，一瓶细胞分三瓶细胞传P2代；S2：P2代脐带间充质干细胞2
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106接种于T85细胞培养瓶中，加入定向诱导分化为成纤维细胞完全培养基20mlDMEM
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F12培养液(含9％FBS，1000u/ml庆大霉素，100u/ml链霉素、重组人碱性成纤维细胞生长因子300u/ml、低分子肝素5u/ml、人表皮生长因子10u/ml 0.5mg/ml脯氨酸)进行成纤维细胞诱导,置于37℃，5％的CO2培养箱培养，每天显微镜下观察，第三天细胞密度大于80％时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，3瓶细胞分9瓶细胞传P3代。S3：P3代脐带间充质干细胞，置于37℃，5％的CO2培养箱培养，培养三天后用定向诱导分化为成纤维细胞完全培养基培养细胞至80％一90％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化1瓶脐带间充质干细胞，上流式细胞仪检测细胞表面标志物，诱导细胞向成纤维细胞分化，免疫组织化学检测I型胶原的表达，脐带间充质干细胞诱导成纤维细胞完成，用0.25％胰蛋白酶消化P3代脐带间充质干细胞诱导成纤维细胞9瓶，收获脐带间充质干细胞诱导的成纤维细胞4
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107数量，置入50ml离心管中用0.9％生理盐水进行吹打清洗，配平上离心机3000转10分钟，弃上清，细胞沉淀于瓶底用生理盐水悬浮，清洗两遍。取出离心管去上清，在用3ml浓缩的脐带间充质干细胞外泌体液重新悬浮间充质诱导分化的成纤维细胞4
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107吹散，过200目细胞筛，备用。S4：收集P1
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P3阶段的脐带间充质干细胞培养过程的换下来的废液，加入5％医用活性炭进行吸附酚红和内毒素，轻轻摇晃5分钟，室温下放置2个小时，置于50ml注射器中，注射器出药口装上0.22um一次性...

【专利技术属性】
技术研发人员：王臣，
申请(专利权)人：吉林省真承药业有限公司，
类型：发明
国别省市：