猫杯状病毒疫苗制造技术

本发明专利技术涉及猫杯状病毒疫苗。具体涉及新的猫衣壳蛋白，包含该衣壳蛋白的活减毒猫杯状病毒，包含该衣壳蛋白的活重组载体病毒和活减毒杂合猫杯状病毒，包含此类活减毒猫杯状病毒的疫苗，活重组载体病毒和活减毒杂合猫杯状病毒，以及用于制备此类病毒的方法。以及用于制备此类病毒的方法。以及用于制备此类病毒的方法。

【技术实现步骤摘要】
猫杯状病毒疫苗
[0001]本申请是申请日为2016年12月22日的中国专利申请201680076354.1
ꢀ“
猫杯状病毒疫苗”的分案申请。


[0002]本专利技术涉及新的猫杯状病毒衣壳蛋白，包含该衣壳蛋白的活减毒猫杯状病毒，包含该衣壳蛋白的活重组载体病毒和活减毒杂合猫杯状病毒，包含此类活减毒猫杯状病毒的疫苗，活重组载体病毒和活减毒杂合猫杯状病毒，以及用于制备此类病毒的方法。

技术介绍

[0003]猫杯状病毒(FCV)是属于杯状病毒科中的水疱疹病毒属的单链正义RNA病毒。该病毒是高度感染性的，并且引起猫的上呼吸道疾病(URD)和口腔溃疡。该病毒还与慢性牙龈炎和口腔炎相关。更近来，出现了通常称为VS
‑
FCV的毒性全身性猫杯状病毒，其引起高死亡率、水肿和溃疡性皮肤损害和黄疸。
[0004]FCV的传播主要通过与鼻腔或口腔分泌物接触(Scherk, M. A.等人, Journal of Feline Medicine and Surgery (2013) 15, 补充文件)。
[0005]杯状病毒科的基因组和基因组组织是本领域中众所周知的。总体概述尤其由Clarke, J.等人(Inf.Diseases 181 (Suppl. 2):S309
‑
316 (2000))公开。猫杯状病毒的第一个完整基因组序列已经于1992年公开(Carter, M. J.等人, Virology 190:443
‑
448 (1992))，并且在后来的年代中，多得多猫杯状病毒的完整基因组序列已经公开(尤其通过Oka, T.等人, GenomeA, May/June 2013, vol. 1, issue 3, e00349
‑
13, Genomea.asm.org)，并且可尤其通过Genbank得到。
[0006]FCV的基因组仅包含三个开放阅读框；ORF 1、2和3。ORF1编码大非结构性多蛋白。ORF3，短3
’‑
末端ORF，编码被认为参与基因组RNA的衣壳化的小蛋白。
[0007]ORF 2是编码FCV衣壳蛋白的开放阅读框。已知衣壳蛋白是触发宿主中的保护性免疫应答的蛋白。因此，衣壳蛋白是用于开发用于针对FCV感染保护猫的疫苗的靶蛋白。
[0008]FCV毒株在全世界仅包含一种血清型，并且主要包含一种血清群。然而，在毒株之间存在相当大的遗传性变异，且因此存在抗原性变异。这种高水平的抗原性变异使得难以获得在猫中针对FCV的广泛保护：尽管用同源毒株接种非常有效，但一种毒株针对另一种毒株的交叉保护水平是相当可变的。(Coyne C.P.等人, J. Virol. 86: 11356
‑
11367 (2012))。
[0009]目前，修饰的活疫苗和灭活疫苗是可得的，并且它们通常全身施用。最初，疫苗曾经是单一疫苗，其主要基于毒株FCV F9或FCV 255。然而，它们都受困于上面鉴定的问题：缺乏广泛的交叉保护。
[0010]目前，至少部分地通过施用包含两种不同的FCV毒株(诸如FCV 431和FCV G1)的二价疫苗来在一定程度上绕开该问题。
[0011]此类(灭活的)二价疫苗目前在美国和欧洲均商业可得。(Poulet H, 等人,
Vaccine 26: 3647
–
3654 (2008), Chengjin Huang等人, Journal of Feline Medicine and Surgery February 12: 129
‑
137 (2010))。
[0012]McCabe V. J.等人开发了活减毒和灭活疫苗的替代方案，其构建了一种活减毒重组载体病毒(LARCV)，在该情况下是粘液瘤病毒，其表达FCV衣壳蛋白，并且成功地将该重组粘液瘤病毒作为LARCV疫苗施用于猫。
[0013]此类基于重组粘液瘤
‑
载体的疫苗具有这样的优点：载体是减毒的，不在猫中复制并且仅携带编码FCV衣壳蛋白的FCV ORF。因此，接种后没有FCV或载体病毒脱落至环境中。
[0014]表达FCV衣壳蛋白的活减毒重组载体病毒的另一个实例是如由Yokoyama, N.等人(J. Vet. Med. Sci. 60:717
‑
723 (1998))所述的猫疱疹病毒载体。该载体还用于针对FCV接种猫。
[0015]然而，还没有开发既安全又显示广泛水平的交叉保护的活减毒FCV疫苗或基于重组载体的疫苗。

技术实现思路

[0016]本专利技术的一个目标是提供安全且仍显示广泛水平的交叉保护的FCV疫苗。
[0017]令人惊讶地发现，存在迄今未知的FCV毒株，其中衣壳蛋白显示针对许多FCV野外毒株的显著广谱的交叉保护。该毒株的代表的衣壳蛋白的实例描绘于SEQ ID NO:34中。其衣壳蛋白序列显示于SEQ ID NO:34中的该新型FCV毒株的代表进一步被称为FCV毒株Kalem Crouch。
[0018]表1显示针对本专利技术的新型FCV毒株产生的抗血清与31种其他FCV毒株的交叉中和特性。显示病毒滴度的log
10
降低。>1.5 log
10
的滴度降低被认为是显著的。
[0019]如下表所示，针对新型FCV毒株Kalem Crouch产生的抗血清令人惊讶地中和了测试的31种FCV毒株中的26种。与常用的F9毒株进行比较。如表1中可见，看到针对F9产生的抗血清仅显示对于测试的22种FCV毒株中的3种的滴度的显著降低。
[0020]已将该新FCV毒株的衣壳蛋白的氨基酸序列与24种其他FCV衣壳蛋白的已知氨基酸序列进行比较，并且可以得出结论，该序列与已知的FCV衣壳蛋白相当显著不同。如从图5可见，新毒株的衣壳蛋白和已知的FCV毒株的衣壳蛋白之间的总体序列同一性为约87％。此外，新衣壳蛋白的几个独特氨基酸被鉴定为K89、M90、M100、I317、L390、A391、V392、Q396、S397、K398、N404、T426、T431、S438、S437、D440、E445、K447、L448、E451、N452、G484、G489、I491、N516、S517、E518、I524、S545、S634、F635、P636。此外，氨基酸447
‑
452的序列KLEYEN和氨基酸489
‑
493的GVISD也是独特的。
[0021]应该理解的是，对于SEQ ID NO:34的氨基酸序列和编码蛋白的DNA，在该毒株的各个代表之间可以存在较小的天然变异。首先，在核苷酸水平上，存在所谓的“第二和第三碱基的摆动”，解释可以存在这样的核苷酸变化，其在其编码的氨基酸序列中仍然未被注意到：例如，三联体TTA、TTG、TCA、TCT、TCG和TCC都编码亮氨酸。此外，在FCV的代表之间可以存在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.与如SEQ ID NO:34中给出的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白，其包含以下氨基酸：K90、M91、M101、I318、L391、A392、V393、Q397、S398、K399、N405、T427、T432、S439、S440、D441、E446、K448、L449、E452、N453、G485、G490、 I492、N517、S518、E519、I525、S546、S635、F636、P637。2.包含根据权利要求1所述的衣壳蛋白的活减毒FCV。3.DNA片段，其特征在于其包含编码根据权利要求1所述的衣壳蛋白的区域。4.根据权利要求3所述的DNA片段，其特征在于将编码衣壳蛋白的区域置于合适启动子的控制下。5.活减毒重组载体病毒(LARCV)，其特征在于所述载体病毒包含在合适启动子控制下的编码根据权利要求1所述的猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白的区域。6.根据权利要求5所述的活减毒重组载体病毒，其特征在于所述LARCV是粘液瘤病毒或猫疱疹病毒。7.根据权利要求5或6所述的活减毒重组载体病毒在制备药物中的用途，所述药物用于针对FCV保护猫。8.活减毒杂合FCV，其特征在于所述FCV包含编码根据权利要求1所述的衣壳蛋白的开放阅读框2(ORF2)或根据权利要求3所述的DNA片段，并且包含来自减毒FCV的开放阅读框1(ORF1)。9.根据权利要求8所述的活减毒杂合FCV，其特征在于所述FCV包含来自FCV毒株F9的ORF1。10.根据权利要求8或9所述的活减毒杂合FCV在制备药物中的用途，所述药物用于针对FCV保护猫。11.细...

【专利技术属性】
技术研发人员：E舒胡，AS鲍格，
申请(专利权)人：英特维特国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：