牛赤羽病病毒疫苗制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种牛赤羽病病毒疫苗。本发明专利技术提供制备牛赤羽病病毒疫苗的蛋白，包括牛赤羽病病毒的G1蛋白和牛赤羽病病毒的G2蛋白，其中，编码G1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码G2蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。该蛋白适用于真核细胞表达系统，改变了牛赤羽病病毒疫苗活性成分制备的工艺，同时降低了成本。并且，该蛋白具有广谱抗原性，可以实现良好的交叉保护效果。果。

【技术实现步骤摘要】
牛赤羽病病毒疫苗


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种牛赤羽病病毒疫苗。

技术介绍

[0002]赤羽病又名阿卡斑病(Akabane disease)，是由赤羽病病毒(Akabane virus，AKAV)所引起的牛、绵羊和山羊的一种多型性传染病，以牛、羊的流产、早产、死产及先天性关节弯曲和积水性无脑症(Arthrogryposis
–
Hydraencephaly，AH综合症)为特征，是危害反刍动物最重要的传染性病毒之一。目前的牛赤羽病病毒疫苗主要有以下形式：1、活疫苗为30℃下在Hmlu
‑
1细胞上致弱的弱毒疫苗；2、灭活疫苗是将OBE
‑
1株AKAV接种Hmlu
‑
1细胞，出现细胞病变时收集细胞培养液，3000rpm离心10min，取上清应用或置于8℃低温保存备用，制备疫苗时加入0.1％福尔马林。上述两种方法均为常规方法，生产工艺复杂，需要耗费较多的人力物力，且引入动物源蛋白，对疫苗的安全性存在潜在风险。
[0003]目前国内该疫病流行广泛，造成了重大的经济损失。尚无该产品上市，有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种牛赤羽病病毒疫苗及其制备方法。
[0005]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种免疫原性组合物，包含牛赤羽病病毒G1蛋白和G2蛋白。
[0006]本专利技术中，编码G1蛋白和G2蛋白的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
[0007]优选地，牛赤羽病病毒G1蛋白和G2蛋白是利用哺乳动物细胞(如CHO细胞)表达系统制备得到的。
[0008]第二方面，本专利技术提供一种牛赤羽病病毒疫苗及其制备方法，包含所述免疫原性组合物和佐剂。
[0009]所述疫苗中牛赤羽病病毒G1蛋白的含量为20
‑
80μg/mL，G2蛋白的含量为20
‑
80μg/mL。
[0010]优选地，所述疫苗中牛赤羽病病毒G1蛋白的含量为60μg/mL，G2蛋白的含量为60μg/mL。
[0011]所述佐剂可以是氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、Gel02、纳米佐剂、蜂胶、ISA206或ISA760VG，优选矿物油佐剂。
[0012]所述免疫原性组合物与所述佐剂的质量比为1:1。
[0013]第三方面，本专利技术提供牛赤羽病病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0014]1)用PBS溶液将牛赤羽病病毒G1蛋白和G2蛋白分别稀释成浓度为120μg/mL、120μg/mL；
[0015]2)将G1蛋白和G2蛋白溶液按体积比1:1混匀即为抗原液；将抗原液与矿物油佐剂
按质量比1:1配苗，在31
±
1℃条件下，以150
‑
350r/min搅拌30
‑
60分钟，乳化成水包油包水型疫苗。
[0016]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0017](一)本专利技术提供的免疫组合物，牛赤羽病病毒G1蛋白和G2蛋白适用于真核细胞表达系统，可以稳定高产量表达，纯度高，抗原免疫性强，可有效应用于该病的研究和诊断。
[0018](二)本专利技术提供的牛赤羽病病毒疫苗，其制备方法简单，且中和抗体结果明显，可有效激活机体的免疫反应，该疫苗生产成本低，广谱性强，对牛赤羽病起到理想的免疫保护作用。
具体实施方式
[0019]下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0020]除非本文另有定义，连同本专利技术使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
[0021]一般地，连同本文描述的细胞和载体构建、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本专利技术的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规实验条件和方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
[0022]本专利技术实施例中用到的主要试剂及仪器信息如下：
[0023]表1试剂及仪器信息表
[0024][0025]实施例1 G1蛋白和G2蛋白的载体构建及免疫原性验证
[0026]1.表达G1蛋白和G2蛋白细胞株的构建
[0027]1.1基因合成
[0028]1.1.1 G1基因合成
[0029]从Geenbank上选用的牛赤羽病基因序列进行比对分析，根据CHO细胞密码子的偏嗜性，将G1基因序列进行密码子优化和修饰，并设计酶切位点，在G1序列的C端添加不同的信号肽序列，并带上His标签，最终得到SEQ ID NO.1。
[0030]将上述编码G1蛋白的核苷酸序列通过BamHI和NotI位点，插入到真核转移载体pcDNA3.1上，用T4 DNA连接酶在16℃过夜连接，经大肠杆菌感受态DH5a转化后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板中，37℃培养过夜后挑取阳性菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒，鉴定无误后备用。
[0031]1.1.2 G2基因合成
[0032]从Geenbank上选用的牛赤羽病基因序列进行比对分析，根据CHO细胞密码子的偏嗜性，将G2基因序列进行密码子优化和修饰，并设计酶切位点，在G2序列的C端添加不同的信号肽序列，并带上His标签，最终得到SEQ ID NO.2。
[0033]将上述编码G2蛋白的核苷酸序列通过BamHI和NotI位点，插入到真核转移载体pcDNA3.1上，用T4 DNA连接酶在16℃过夜连接，经大肠杆菌感受态DH5a转化后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板中，37℃培养过夜后挑取阳性菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒，鉴定无误后备用。
[0034]2载体构建：采用常规重组质粒构建流程。
[0035]2.1细胞转染
[0036]将上述两种质粒分别转染至生长良好全悬浮的CHO细胞，3日后进行细胞传代，并在培养基内加入800μg/ml的G418，加压至活率在30％左右时，停止加压。用常规的培养基培养，换入新的贴壁培养基培养7天，当细胞活率达到90％以上时，再加压筛选一次，同样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.免疫原性组合物，其特征在于，包含牛赤羽病病毒G1蛋白和G2蛋白，其中编码G1蛋白和G2蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述牛赤羽病病毒G1蛋白和G2蛋白利用哺乳动物细胞表达系统制备得到。3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。4.牛赤羽病疫苗，其特征在于，包含权利要求1或2中所述的免疫原性组合物和佐剂。5.根据权利要求3所述的牛赤羽病疫苗，其特征在于，所述疫苗中牛赤羽病病毒G1蛋白的含量为20
‑
80μg/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，李俊辉，程兰玲，张伟，张淑琴，
申请(专利权)人：天康制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：