一种用于制备PRRSV基因II型表位缺失疫苗毒株的N蛋白表位突变标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于制备PRRSV基因II型表位缺失疫苗毒株的N蛋白表位突变标记及其应用，属于生物制品技术领域。所述突变标记在PRRSV基因II型N蛋白C端92～103位表位序列的基础上突变一个或多个氨基酸，所述表位突变标记的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中X1可以为T、P或A，X2为V或A。本发明专利技术通过鉴定PRRSV基因II型病毒N蛋白中优势抗原表位，证明将此表位缺失后可以有效区分自然感染动物与表位缺失全病毒灭活疫苗或弱毒疫苗免疫动物，为PRRSV免疫净化防控产品的制备提供了依据。PRRSV免疫净化防控产品的制备提供了依据。PRRSV免疫净化防控产品的制备提供了依据。

【技术实现步骤摘要】
一种用于制备PRRSV基因II型表位缺失疫苗毒株的N蛋白表位突变标记及其应用


[0001]本专利技术属于生物制品
，具体涉及一种用于制备PRRSV基因II型表位缺失疫苗毒株的N蛋白表位突变标记及其应用。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的严重危害世界养猪业的高度接触性传染病。该病主要引起仔猪、育肥猪的呼吸道疾病和母猪的繁殖障碍，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV是一种单股正链RNA病毒，基因组全长约15kb，主要感染肺泡巨噬细胞(PAM)、成熟单核细胞、小胶质细胞等抗原递呈细胞。
[0003]疫苗免疫对于PRRS的防控具有一定的效果，疫苗包括弱毒疫苗与灭活疫苗，但均存在一定的缺点。弱毒疫苗存在毒力返强、田间流行毒与疫苗毒重组变异等现象，如果临床使用的弱毒疫苗株多，则可能进一步促进病毒重组变异，使疫病流行形势复杂化。灭活疫苗的问题是对同源毒株的保护效果较好，对异源流行病毒的交叉免疫保护不足。随着，重组变异毒株的不断出现，越来越多的专家认识到，应重视灭活疫苗的使用，以改变PRRS防控的复杂局面。
[0004]目前，不管是弱毒疫苗或灭活疫苗均不能有效区分自然感染与疫苗免疫动物，无法进行感染状况评估与免疫猪群内疫病的净化。因此，制备PRRS表位缺失负标记疫苗是目前PRRS防控产品研究的重点。现有技术中用于区别PRRSV自然感染和疫苗免疫的方法，是利用疫苗免疫动物后，不产生针对美洲株PRRS病毒M蛋白线性表位的抗体，通过检测所述抗体，实现区分自然感染与疫苗免疫动物(CN 105749267A，公开日2016年7月13)，再例如，区分牛布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染状态的方法只需对一个样本同时检测其IgG和IgM就可对自然感染和疫苗免疫进行区分(CN108037277A，公开日为2018年5月15日)。还有通过同源重组技术敲除靶基因或多肽位点，通过检测目标基因或多肽区分疫苗免疫动物和野生菌感染动物(CN111057671A，2020年4月24日；CN104165998A，公开日为2016年8月)。虽然构建敲除抗原表位的疫苗便于后续区分鉴定，但对敲除的位点有严格限制，比如不恰当敲除抗原表位可能会降低疫苗抗原的免疫原性，降低疫苗的免疫效果。因此鉴定PRRSV的优势非保护性抗原表位，将此表位缺失后制备标记疫苗，才能有效区分自然感染与表位缺失全病毒疫苗免疫动物。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种PRRSV的N蛋白线性非中和表位突变标记位点，可以根据该位点制备表位缺失灭活疫苗或弱毒疫苗，用于区分PRRSV自然感染动物和全病毒疫苗免疫动物。
[0006]本专利技术提供了一种用于制备PRRSV基因II型表位缺失标记疫苗毒株的N蛋白表位突变标记，在PRRSV基因II型N蛋白C端92～103位氨基酸序列的基础上突变一个或多个氨基酸；
[0007]所述N蛋白表位突变标记的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中X1为T、P或A，X2为V或A。
[0008]优选的，当突变1个氨基酸位点时，突变表位中的任何一个位点氨基酸，优选为突变93位丝氨酸。
[0009]优选的，当突变多个氨基酸时，包括连续或非连续突变2～12个氨基酸。
[0010]优选的，所述突变包括突变修饰、缺失或插入异源序列。
[0011]优选的，所述突变修饰包括氨基酸替换。
[0012]本专利技术提供了一种表位缺失全病毒PRRSV疫苗，所述疫苗含有所述N蛋白表位突变标记的PRRSV。
[0013]优选的，所述PRRSV为PRRSV基因II型。
[0014]本专利技术提供了PRRSV N蛋白的猪源单个B细胞抗体C8在制备检测所述PRRSV表位缺失疫苗的试剂或试剂盒中的应用。
[0015]本专利技术提供了一种用于制备PRRSV基因II型表位缺失疫苗毒株的N蛋白表位突变标记，在PRRSV的N蛋白C端92～103位氨基酸序列的基础上进行一个或多个氨基酸位点突变；所述表位突变标记的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中X1为T、P或A，X2为V或A。本专利技术鉴定了PRRSV基因II型病毒N蛋白C端的非保护性优势抗原表位，将此表位突变后可有效区分自然感染动物与表位缺失全病毒疫苗免疫动物，为PRRSV免疫净化防控策略的制与实施提供技术依据。
附图说明
[0016]图1为在293T细胞中转染pcDNA3.1
‑
N和pcDNA3.1空载体，用C8和GAPDH抗体进行Westernblot结果；
[0017]图2为合成肽ELISA检测C8单抗与N蛋白的N19肽段反应结果；
[0018]图3为N蛋白83～112位多肽连续三点突变后与C8单抗的反应性检测结果；
[0019]图4为N蛋白92
‑
103位单点突变后与C8单抗的反应性检测结果；
[0020]图5为表位缺失N蛋白与正常N蛋白转染293T细胞后与C8单抗的反应性检测；
[0021]图6为利用N蛋白抗体竞争ELISA方法检测原核表达的N蛋白及N92
‑
94A突变蛋白、GST蛋白免疫小鼠血清结果；
[0022]图7为不同基因型PRRSV毒株和LDV的N蛋白氨基酸序列比对结果；
[0023]图8为rGSWW2015/N/S93A和rGSWW2015/N/S93A+D94A感染Marc
‑
145细胞48小时后SR30A单抗和C8单抗间接免疫荧光结果。
具体实施方式
[0024]本专利技术提供了一种制备PRRSV基因II型表位缺失疫苗毒株的N蛋白表位突变标记位点，在PRRSV基因II型N蛋白C端92～103位氨基酸序列的基础上突变一个或多个氨基酸；所述N蛋白表位突变标记的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中X1为T、P或A，X2为V或A。
[0025]在本专利技术中，所述表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(LSDGRISYX1X2EF)所示。在不同PRRSV毒株中，N蛋白C端92～103位的多肽的序列不是完全保守的，在100位和101位点存在氨基酸变异，X1可以为T、P或A，X2可为V或A。所述表位的来源毒株优选包括GSWW/2015、MN184A、MN184B和JX
WN
06等基因II型毒株。
[0026]在本专利技术中，所述突变优选包括缺失或替换。所述替换优选包括将表位序列中任一位置的氨基酸替换为其他种类的氨基酸，例如替换为丙氨酸。所述突变的位点数量为1个氨基酸位点时，优选突变93位丝氨酸。实施例研究结果表明，93位丝基酸突变后与C8的反应性明显降低，证明93位的丝氨酸是C8抗体识别的最关键位点。当突变多个氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于制备PRRSV基因II型表位缺失疫苗毒株的N蛋白表位突变标记，其特征在于，在PRRSV基因II型N蛋白C端92～103位氨基酸序列的基础上突变一个或多个氨基酸；所述N蛋白表位突变标记的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中X1为T、P或A，X2为V或A。2.根据权利要求1所述用于制备PRRSV基因II型表位缺失标记疫苗毒株的N蛋白线性表位突变标记，其特征在于，当突变1个氨基酸位点时，突变表位中的任何一个位点氨基酸；优选的，突变93位丝氨酸。3.根据权利要求1所述用于制备PRRSV基因II型表位缺失标记疫苗毒株的N蛋白线性表位突变标记，其特征在于，当突变多个氨基酸时，包括连续或不连续突变2～12个氨基酸。4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：张婧，卢曾军，李坤，孙普，王健，曹轶梅，包慧芳，赵志荀，李平花，付元芳，马雪青，袁红，白兴文，张强，李冬，刘在新，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：