一种可溶性VP2抗原、疫苗、抗原的制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，提供了一种可溶性VP2抗原，所述VP2抗原通过将VP2基因克隆到pColldⅢ载体上构成表达质粒pColld

【技术实现步骤摘要】
一种可溶性VP2抗原、疫苗、抗原的制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，更具体而言，涉及一种可溶性VP2抗原、疫苗、抗原的制备方法。

技术介绍

[0002]鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是一种由鸡传染性法氏囊病病毒 (Infectious bursal disease Virus，IBDV)感染引起的鸡急性、高度接触性传染病，以法氏囊发炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征，从而导致鸡的免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果。感染IBDV后，雏鸡群在短时间内大量死亡或鸡群产肉、产蛋等生产性能大幅度下降，带来直接经济损失。
[0003]接种疫苗是一种有效的预防传染性法氏囊病的措施，目前预防这种疾病有两种主要方法：一是采用灭活疫苗，但这种灭活疫苗必需具有相当高的病毒抗原滴度才有作用。另一种有效方法是应用未完全减毒的中等毒力活疫苗，其主要目的是提供足够强的免疫刺激以使免疫鸡产生对强毒和超强毒株的保护作用。然而，这些中等毒力活疫苗本身也可能会造成免疫抑制并干扰其它疫苗的免疫作用。它们的生产均必须依赖动物细胞、鸡胚、活体动物等基质，在产量上存在较大局限性，需要较高的成本，且培育过程易引入外源病毒，导致疫苗污染。因此，迫切需要一种低成本、大规模、高效的IBDV疫苗生产方式适应行业需要。除此之外，近年来鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)变异株和超强毒株的出现，经常导致免疫失败，传统的灭活疫苗和弱毒疫苗已经面临着严峻的考验，基因工程亚单位疫苗的出现为鸡传染性法氏囊病预防提供了一条新的途径。
[0004]随着分子生物学的发展，高新技术疫苗已成为研究的前沿领域，以分子生物学技术的基本方法研究开发兽用新型疫苗是21世纪的主导方向。重组亚单位疫苗是用基因工程DNA重组技术将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达基因产物——蛋白质或多肽制成的疫苗，与传统疫苗相比较具有安全性高、纯度高，稳定性好以及产量高等优点，该类疫苗是目前使用最广泛的新型疫苗。以大肠杆菌生产亚单位疫苗较为常见，但依旧存在不足之处：由于其革兰氏阴性菌的特性，内毒素问题长期存在；表达的蛋白缺乏糖基化、磷酸化修饰，大大降低生物学活性，以上问题均对疫苗质量产生影响，生产上需找到新的替代菌种。除此之外，制备基因工程亚单位疫苗的关键是筛选出新的，具有更好免疫原性的抗原基因。
[0005]众做周知的，冷休克载体是提高蛋白可溶性的一种有效载体，但是经过大量的研究发现，提高疫苗的有效性，提高蛋白的可溶性仅仅是一个并非100％有效的技术手段。
[0006]具体可参考：CN201710278425.2公开了一种融合表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白的重组乳酸菌菌株及其用途。所述的重组乳酸菌菌株，含有经优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的基因序列以及编码沙门菌属外膜蛋白OMP的基因序列。实验证明该重组乳酸菌菌株其能够高效融合表达VP2蛋白和外膜蛋白OMP，且以可溶性形式存在于细胞质中。重组乳酸菌菌株直接作为疫苗免疫鸡，实验结果表明：该重组乳酸菌菌株能有效诱导机体产生特异性的免疫应答，主要产生特异性中和抗体，使免疫鸡获得
100％的抵抗高致病力vvIBDV致死性攻击的保护，并可清除体内残留的病毒，达到清除性免疫的目的。该方案所提出为鸡传染性法氏囊病的防治提供了一种新的技术手段。
[0007]在该案的说明书的倒数第一段、第二段记载：将1日龄SPF雏鸡随机分4组，每组10 只，r
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L.lactis
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OMPH
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VP2免疫组分别为口服免疫1
×
1010CFU/mL重组乳酸乳球菌(500μL)，颈部皮下注射免疫1
×
1010CFU/mL重组乳酸乳球菌r
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L.lactis
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OMPH
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VP2(200μL)； r
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L.lactis
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VP2免疫组采用颈部皮下注射免疫1
×
1010CFU/mL重组乳酸乳球菌 r
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L.lactis
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VP2(200μL)；空载体菌株免疫组作为对照组，采用颈部皮下注射免疫1
×
1010CFU/mL 含有空载体的乳酸乳球菌(200μL)。各组在7日龄时进行首次免疫；14日龄进行二次免疫；同时在首免后和二免后一周采集血清，口服免疫组采集口咽拭子和泄殖腔拭子；30日龄时，用 1000个ELD
50
的HLJ0504超强毒株进行攻毒保护试验，攻毒后观察10天左右，记录各组SPF 鸡的发病情况及存活率。
[0008]实验结果显示：(1)注射免疫r
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L.lactis
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OMPH
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VP2实验组攻毒保护率可达到100％，口服 r
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L.lactis
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OMPH
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VP2免疫实验组攻毒保护率可达到60％；(2)口服免疫rL.lactis
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OMPH
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VP2 组和注射免疫r
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L.lactis
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OMPH
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VP2组的血清ELISA抗体为阴性，但产生了较高的血清中和抗体(1:26到1:210)；(3)口服免疫r
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L.lactis
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OMPH
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VP2组在首免一周后和二免一周后肠道黏膜sIgA抗体滴度相比于其他两组明显升高，并且均差异性显著(P<0.05)。重组乳酸乳球菌 r
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L.lactis
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OMPH
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VP2经注射和口服免疫后均可以诱导机体产生特异性的免疫应答。注射组试验鸡法氏囊组织全部保护，实验组攻毒观察10日后囊指数大于0.7，全部保护。(4)而注射免疫r
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L.lactis
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VP2实验组攻毒保护率为0；(5)空菌对照实验组攻毒保护率为0。
[0009]针对IBDV强毒株HLJ0504，r
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L.lactis
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OMPH
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VP2实验组攻毒保护率可达到100％，免疫r
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L.lactis
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VP2实验组攻毒保护率为0，所以可以明显的得知，都为可溶性蛋白，在该案例中，必须将OMPH蛋白和VP2蛋白融合后才能达到较强的免疫效果。
[0010]经过更为深入的研究发现：可溶性蛋白仅仅是提高免疫力的一个因素，蛋白可溶但不代表其具有生物活性，若其他因素未做优化，其大概率是无法达到高免疫效果的目的。
[0011]更好的免疫效果来源于表达的蛋白结构是否正确折叠形成有活性形式，是否更接近天然蛋白的构象。
[0012]现有技术存在的问题在于：如何提高VP2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可溶性VP2抗原，其特征在于，所述VP2抗原通过将VP2基因克隆到pColldⅢ载体上构成表达质粒pColld
Ⅲ‑
VP2，转化进入BL21(DE3)感受态细胞(pTf16分子伴侣)，得到基因工程菌种Escherichia coli pTf16/BL21/pColld
Ⅲ‑
VP2，提取得到可溶性VP2抗原；所述VP2基因的核苷酸序列如核苷酸序列NO.1所示。2.一种VP2亚单位疫苗，其特征在于，含如权利要求1所述的可溶性VP2抗原。3.根据权利要求1所述的VP2亚单位疫苗，其特征在于，VP2抗原的浓度为1mg/mL。4.根据权利要求1所述的VP2亚单位疫苗，其特征在于，为油包水乳液，其含有弗氏佐剂，弗氏佐剂和VP2抗原的浓度比为1:1。5.一种如权利要求1所述的可溶性VP2抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：制备经密码子优化的VP2基因；步骤2：将步骤1的VP2基因连接到pColldⅢ载体上，得到表达质粒pColld
Ⅲ‑
VP2；步骤3...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞爱，何献铭，任广彩，兰虹，罗琼，熊挺，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：