一种抗原纯化处理方法技术

本发明专利技术涉及一种抗原纯化处理方法，其主要包含以下步骤：a)将收集到的细胞发酵液离心处理；b)向离心后发酵液中加入的硅藻土，搅拌；c)将搅拌后发酵液以固定流速通过深层纸板过滤；d)收获过滤后溶液；e)对过滤后溶液进行超滤及2倍浓缩。采用本发明专利技术中的抗原纯化处理方法，可使得样品溶液浊度降低75％以上，成品疫苗副反应更低、操作步骤简单、人工和材料成本较低，能够应用于疫苗的大规模工业生产。够应用于疫苗的大规模工业生产。够应用于疫苗的大规模工业生产。

【技术实现步骤摘要】
一种抗原纯化处理方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种抗原纯化处理方法。

技术介绍

[0002]猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine FeverVirus，CSFV)引起的一种以高热、出血和高死亡率为特征的接触性传染病，家养和野生猪是其唯一的天然宿主。国际兽医局(OIE)将其定为A类疫病，我国《动物防疫法》将其列为一类疫病，为法定上报疫病，当前无特效药治疗，主要防治手段为疫苗接种。
[0003]猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属，呈球形，核衣壳为12面体对称，有囊膜，病毒粒子表面有不规则形状的纤突。CSFV为单链线状RNA病毒，基因组长约12.5kb，病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜。中间编码区含有1个大的开放性阅读框(ORF)，能编码约3898个基因，编码8种非结构蛋白和4种结构蛋白，其中4种结构蛋白分别为C、Erns、E1和E2结构蛋白。而E2是CSFV最主要的免疫原性结构蛋白，能够诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗CSFV强毒株的攻击，是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。
[0004]中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是由puck于1957年在中国仓鼠卵巢细胞发现的成纤维细胞系，发展至今，已经成为外源基因的最佳真核表达系统之一，也是生物制药、疫苗开发中最常用的哺乳动物细胞。外源蛋白通过发酵培养在CHO细胞中大量合成并分泌到培养基中，通过收集和纯化后得到目的蛋白，从而完成疫苗的制备。然而，细胞培养液中包含大量的细胞碎片、宿主细胞蛋白、细胞代谢物、剩余培养基、高分子聚合物等众多杂质，分离纯化后才能获得可用于免疫的目标抗原。目前，常用的抗原分离纯化手段包括离心、过滤、超滤、层析等方法。
[0005]但是离心、过滤等处理方法存在以下问题：1、离心后样品浊度高，耗时长、通量小，样品处理效率低；2、进行超滤浓缩工作时，杂蛋白堵塞中空纤维柱，且猪瘟E2蛋白收率低，损失大；3、抗原蛋白纯度低，疫苗副反应大。鉴于上述问题，开发一种便于放大生产、成本低、收率高、纯度高的猪瘟E2抗原纯化方法，是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种抗原纯化处理方法，以解决现有技术中发酵液浊度高、收率低、纯度低、后处理困难等问题。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]一种抗原纯化处理方法，包含以下步骤：
[0009]a)将收集到的细胞发酵液离心处理；
[0010]b)向离心后发酵液中加入的硅藻土，搅拌；
[0011]c)将搅拌后发酵液以固定流速通过深层纸板过滤；
[0012]d)收获过滤后溶液；
[0013]e)对过滤后溶液进行超滤及2倍浓缩。
[0014]上述抗原纯化处理方法中，所述步骤a)中离心力为4000
‑
8000g，优选为6500g；所述离心时间为15
‑
30min，优选为20min。
[0015]上述抗原纯化处理方法中，所述步骤b)中硅藻土二氧化硅含量90
‑
94％，细度为120
‑
200目；优选为二氧化硅含量92
‑
94％，细度为120
‑
150目；更优选为二氧化硅含量92％，细度为150目；进一步优选的，所述硅藻土型号为CELITE 577。
[0016]所述搅拌时间为3
‑
10min，优选为5min。
[0017]上述抗原纯化处理方法中，所述步骤b)中硅藻土的质量为发酵液体积的0.5
‑
1.5％，更优选为0.5
‑
1％，进一步优选为1％(即每升发酵液中硅藻土用量为10g)。
[0018]上述抗原纯化处理方法中，所述步骤c)中深层纸板的孔径为0.2
‑
0.8μm，优选为0.2
‑
0.6μm；更优选为0.4
‑
0.6μm，所述深层纸板型号为CH ST 130(P)。
[0019]上述抗原纯化处理方法中，所述步骤c)中发酵液的流速为0.25
‑
0.8mL/(min
·
cm2)，优选为0.5mL/(min
·
cm2)。
[0020]本专利技术所提供的抗原纯化处理方法中，所述蛋白为猪瘟E2蛋白；进一步地，所述猪瘟E2蛋白由CHO细胞表达得到。
[0021]上述抗原纯化处理方法中，所述细胞发酵液的收集步骤为：包含猪瘟E2基因的CHO细胞按照流加培养工艺进行培养，培养中最高活细胞密度可达到12
±4×
106cells/mL，收获时活细胞密度在5
±2×
106cells/mL，活率在70
±
20％，收集得到发酵液。
[0022]专利技术人通过实验发现，发酵液的按照6500g进行20min离心，此时浊度为80
±
20NTU；向离心后的发酵液中加入硅藻土，硅藻土质量为发酵液体积的1％，搅拌5min；将发酵液按照0.5mL/(min
·
cm2)的流速过滤孔径为0.4
‑
0.6μm的深层纸板，纸板型号为CH ST 130(P)，收获过滤后的发酵液，此时浊度为10
±
5NTU；将过滤后的发酵液使用中空纤维柱进行超滤及2倍浓缩，蛋白收率在95％以上。
[0023]本申请与现有技术相比，具有以下优点：采用本申请中的抗原纯化处理方法，获得的样品溶液浊度降低75％以上，后超滤浓缩处理简单，一步获得蛋白的收率提升20％以上，总收率可达到95％以上，该方法得到的抗原制备得到的成品疫苗副反应更低；同时本申请方法操作步骤简单、人工和材料成本较低，能够应用于疫苗的大规模工业生产，提高生产效率，节约生产成本。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1为实施例3中实验例的抗原浊度变化图，其中A为收获抗原，B为离心后抗原，C为澄清后抗原，D为2倍浓缩后抗原。
[0026]图2为实施例3中对比例的抗原浊度变化图，其中A为离心后抗原，B为2倍浓缩后抗原。
[0027]图3为实施例3中实验例的SDS
‑
PAGE检测图，其中2号泳道为离心后10倍稀释SDS
‑
PAGE蛋白定量，蛋白含量为1225.90μg/mL；4号泳道为硅藻土澄清后10倍稀释SDS
‑
PAGE蛋白
定量，蛋白含量为1200.90μg/mL；7号泳道为硅藻土两倍浓缩后20倍稀释SDS
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗原纯化处理方法，其特征在于，包含以下步骤：a)将收集到的细胞发酵液离心处理；b)向离心后发酵液中加入的硅藻土，搅拌；c)将搅拌后发酵液以固定流速通过深层纸板过滤；d)收获过滤后溶液。2.根据权利要求1中所述的抗原纯化处理方法，其特征在于所述步骤c)中深层纸板的孔径为0.2
‑
0.8μm，优选为0.2
‑
0.6μm；更优选为0.4
‑
0.6μm；进一步优选地，所述深层纸板型号为CH ST 130(P)。3.根据权利要求1中所述的抗原纯化处理方法，其特征在于所述步骤b)中硅藻土二氧化硅含量90
‑
94％，细度为120
‑
200目；优选为二氧化硅含量92
‑
94％，细度为120
‑
150目；更优选为二氧化硅含量92％，细度为150目；进一步优选地，所述硅藻土型号为CELITE577。4.根据权利要求1中所述的抗原纯化处理方法，其特征在于所述步骤b)中硅藻土与发酵液的质量体积百分比为0.5
‑
1.5％，更优选为0.5
‑
1％，进一步优选为1％。5.根据权利要求1中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，石丁锋，张淑香，李天增，徐龙飞，王遵宝，赵晓英，
申请(专利权)人：天康制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：