用于预防猪繁殖与呼吸综合征的mRNA疫苗及制备方法技术

本发明专利技术涉及mRNA疫苗技术领域，尤其是涉及用于预防猪繁殖与呼吸综合征的mRNA疫苗及制备方法。本发明专利技术利用猪繁殖与呼吸综合征病毒的结构蛋白和非结构蛋白，开发一种预防猪繁殖与呼吸综合征的mRNA疫苗，该疫苗使用后能够模拟天然感染的过程，在机体细胞内被翻译、修饰，可以被MHCI类分子和MHCII类分子呈递，诱发更强的细胞免疫和体液免疫应答，即双重功效。并且，本发明专利技术提供的mRNA具有自佐剂效应，无需进行佐剂筛选，即工序简化，功能强大。功能强大。功能强大。

【技术实现步骤摘要】
用于预防猪繁殖与呼吸综合征的mRNA疫苗及制备方法


[0001]本专利技术涉及mRNA疫苗
，尤其是涉及用于预防猪繁殖与呼吸综合征的mRNA疫苗及制备方法。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的母猪流产、死产、木乃伊胎等繁殖障碍以及各年龄猪的呼吸道症状为临床特征的一种高度接触性传染病。病毒主要危害为各年龄猪均感染，不同品种、性别及猪龄均有发病。病毒感染后排毒时间长，因此病毒可经水平和垂直传播方式在猪群中反复传播，很难根治。对母猪危害主要表现为母猪繁殖障碍、免疫力低下、延迟发情等。该病最初有外国流行传入我国，给我国生猪养殖业带来巨大危害，直接经济损失数十亿元。
[0003]PRRSV有囊膜，颗粒呈圆形，直径通常为40～60nm。囊膜表面含有不同基因编码的结构蛋白，其中GP3、GP4、GP5以及M蛋白为主要的囊膜蛋白，这些蛋白均含有中和抗原表位，能够诱导机体产生中和抗体，均被用于诊断和疫苗研究的候选抗原，具有重要的研究价值。
[0004]目前mRNA疫苗在人用疫苗，即新型冠状病毒疫苗、流感疫苗、寨卡疫苗等，取得了较快的发展，部分疫苗已用于到人体实验，取得了良好的效果。面对目前各种PRRSV疫苗在临床应用上出现的复杂问题，选择mRNA疫苗进行PRRS防控是一种不错的选择途径。
[0005]mRNA是编码DNA转录和细胞质核糖体产生蛋白质的中间步骤。mRNA疫苗的核心原理是将编码一个或多个免疫原的基因序列传递到宿主细胞的细胞质中，随后在细胞内表达翻译蛋白即抗原，使其位于细胞膜内或分泌到细胞膜外，进而呈现在主要组织相容性复合物(MHC)上即MHC I类和MHC II类，然后被CD8+和CD4+T细胞识别从而启动适应性免疫应答。mRNA疫苗在靶细胞内产生抗原，模拟了病毒在人体内自然感染的过程，能够有效的引起体液免疫与细胞免疫，安全性较高。mRNA疫苗可以绕过毒株、菌株等获取方面的限制，支持提供任何特定的抗原，无论是来自病毒、细菌还是寄生虫，能够支持针对多种病原体的疫苗开发。
[0006]mRNA疫苗相较于亚单位、灭活病毒和减毒活病毒以及DNA的疫苗具有一定相对优势。(1)安全性高:由于mRNA疫苗是一个非感染性、非整合平台技术，因此不存在感染或插入突变和基因组与宿主染色体潜在整合的风险。此外，mRNA能够被正常的细胞自然降解，其在体内的半衰期可以通过各种修饰和递送系统来调节。(2)高效率:多种修饰使mRNA更稳定，更易翻译。通过将mRNA合成载体分子，使其在细胞质中快速摄取和表达，可以实现高效的体内给药。mRNA是最小的遗传载体，因此避免了抗载体免疫，可以重复接种mRNA疫苗。(3)可大规模生产且成本低，不需要在细菌或细胞培养物中扩增，因此mRNA疫苗具有快速、廉价和可扩展的生产潜力。
[0007]目前国内还没有猪繁殖与呼吸综合征病毒mRNA疫苗研制上市的产品，因此开发一种mRNA疫苗，用于预防猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染。
[0008]综上所述，现有PRRSV疫苗存在的问题是:
[0009](1)PRRSV灭活疫苗：具有安全、便于贮存和运输、母源抗体的干扰作用不敏感，但免疫剂量大、免疫次数多、免疫空白期长、产生大量非中和抗体，对异源毒株几乎没有保护作用，难以控制和根除PRRSV在猪场存在和流行，无法产生细胞免疫应答。
[0010](2)PRRSV弱毒疫苗：弱毒疫苗抗体产生较快，诱导细胞免疫应答，但存在弱毒苗毒株毒力返强的风险，导致病毒的重组与变异，不利于疫病清除。
[0011](3)DNA疫苗：目前有关于PRRSV DNA疫苗研究的报道，其存在的问题是，DNA可以整合到细胞的DNA中，造成机体癌基因的激活和自身免疫反应，具有潜在的生物安全风险。
[0012](4)PRRSV疫苗生产工艺复杂，生产规模庞大，占地面积较大，无形中增加生产成本。
[0013]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0014]本专利技术的第一个目的在于，利用猪繁殖与呼吸综合征病毒的结构蛋白和非结构蛋白，开发一种预防猪繁殖与呼吸综合征mRNA疫苗，该疫苗施用后能够模拟天然感染的过程，在机体细胞内被翻译、修饰，可以被MHCI类分子和MHCII类分子呈递，诱发更强的细胞免疫和体液免疫应答，即双重功效。
[0015]本专利技术的另一个目的在于，提供制备上述mRNA疫苗的方法，以期能够实现快速安全生产，适宜推广应用。
[0016]为了解决上述技术问题，实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0017]第一方面，本专利技术提供含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白在制备mRNA疫苗中的应用，所述结构蛋白选自(
ⅰ
)～(
ⅲ
)中至少一种；
[0018](
ⅰ
)膜蛋白或其衍生物；
[0019](
ⅱ
)M蛋白或其衍生物；
[0020](
ⅲ
)N蛋白或其衍生物。
[0021]优选地，所述膜蛋白包括GP3、GP4或GP5中至少一种。
[0022]第二方面，本专利技术提供了前述实施方式所述含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白联合具有抗原活性的非结构蛋白在制备mRNA疫苗中的应用，所述非结构蛋白包括Nsp蛋白或其衍生物；
[0023]优选地，所述Nsp蛋白包括Nsp2、Nsp9或Nsp10中至少一种。
[0024]第三方面，本专利技术提供第一mRNA分子，所述第一mRNA分子编码第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括通过柔性linker连接的至少两个来源于含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白的多肽片段。
[0025]优选地，所述含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白选自前述实施方式所述的结构蛋白。
[0026]优选地，编码GP3蛋白的开放编辑框ORF3的核苷酸序列为SEQ ID No.1。
[0027]优选地，编码GP4蛋白的开放编辑框ORF4的核苷酸序列为SEQ ID No.2。
[0028]优选地，编码GP5蛋白的开放编辑框ORF5的核苷酸序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4。
[0029]优选地，编码M蛋白的开放编辑框ORF6的核苷酸序列为SEQ ID No.5。
[0030]优选地，编码N蛋白的开放编辑框ORF7的核苷酸序列为SEQ ID No.6。
[0031]第四方面，本专利技术提供第二mRNA分子，所述第二mRNA分子编码第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括通过柔性linker连接的至少一个前述实施方式所述的多肽片段和至少一个来源于具有抗原活性的非结构蛋白的多肽片段。
[0032]优选地，所述具有抗原活性的非结构蛋白选自前述实施方式所述的非结构蛋白。
[0033]优选地，编码Nsp本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白在制备mRNA疫苗中的应用，所述结构蛋白选自(
ⅰ
)～(
ⅲ
)中至少一种；(
ⅰ
)膜蛋白或其衍生物；(
ⅱ
)M蛋白或其衍生物；(
ⅲ
)N蛋白或其衍生物；优选地，所述膜蛋白包括GP3、GP4或GP5中至少一种。2.权利要求1所述含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白联合具有抗原活性的非结构蛋白在制备mRNA疫苗中的应用，所述非结构蛋白包括Nsp蛋白或其衍生物；优选地，所述Nsp蛋白包括Nsp2、Nsp9或Nsp10中至少一种。3.第一mRNA分子，其特征在于，所述第一mRNA分子编码第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括通过柔性linker连接的至少两个来源于含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白的多肽片段；优选地，所述含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白选自权利要求1所述的结构蛋白；优选地，编码GP3蛋白的开放编辑框ORF3的核苷酸序列为SEQ ID No.1；优选地，编码GP4蛋白的开放编辑框ORF4的核苷酸序列为SEQ ID No.2；优选地，编码GP5蛋白的开放编辑框ORF5的核苷酸序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4；优选地，编码M蛋白的开放编辑框ORF6的核苷酸序列为SEQ ID No.5；优选地，编码N蛋白的开放编辑框ORF7的核苷酸序列为SEQ ID No.6。4.第二mRNA分子，其特征在于，所述第二mRNA分子编码第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括通过柔性linker连接的至少一个权利要求3所述的多肽片段和至少一个来源于具有抗原活性的非结构蛋白的多肽片段；优选地，所述具有抗原活性的非结构蛋白选自权利要求2所述的非结构蛋白；优选地，编码Nsp2蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列选自SEQ ID No.18～SEQ ID No.20中任一条序列；优选地，编码Nsp9蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列为SEQ ID No.21；优选地，编码Nsp10蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列为SEQ ID No.22。5.构建体，其特征在于，所述构建体包括第一mRNA分子或第二mRNA分子，所述构建体的核苷酸序列还包括UTR序列、Kozak序列、信号肽编码序列、启动子序列和poly(A)序列；优选地，所述UTR序列包括核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的5
’
UTR序列和核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的3
’
UTR序列；优选地，所述Kozak序列的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；优选地，编码所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；优选地，所述启动子包括T7启动子，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；优选地，所述poly(A)的碱基长度为50～150bps，进一步优选为129bps。6.生物材料，其特征在于，包括：(a)重组载体，包括权利要求5所述的构建体和质粒载体；(b)转化体，包括含有权利要求5所述的构建体，或(a)重组载体的宿主细胞；优选地，所述质粒载体包括pcDNA3.1、CET 1019HS

【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，张伟，李俊辉，程兰玲，杜久斌，曹剑，潘晓梅，王雨朦，张淑琴，
申请(专利权)人：天康制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：