用于产生针对HPV和与该病毒相关的癌症的预防性和治疗性DNA的免疫学组合物的方法，杂合蛋白，表达载体，免疫学组合物，及其用途技术

本发明专利技术涉及针对HPV和与该病毒相关的癌症的预防性和治疗性疫苗，其旨在用于寻求预防的人或者已发展出了癌症的已经被HPV感染的那些人。本发明专利技术还涉及DNA表达载体，其能够有效地产生HPV16病毒的衣壳蛋白L2，以及还有与人乳头瘤病毒肿瘤相关的病毒癌蛋白E6。特别地，本发明专利技术涉及通过基因克隆到表达载体中来获得重组的融合或杂合蛋白，其通过经由将一个或多个基因的核酸调控序列与一个或多个基因的蛋白质编码序列相组合而形成的融合基因的基因翻译来产生，其用于生成两种不同类型的应答：持久的体液免疫应答，其能够刺激针对HPV的特异性抗

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生针对HPV和与该病毒相关的癌症的预防性和治疗性DNA的免疫学组合物的方法，杂合蛋白，表达载体，免疫学组合物，及其用途
专利

[0001]本专利技术涉及针对HPV和与该病毒相关的癌症的预防性和治疗性疫苗，其旨在用于任何对预防疾病感兴趣的人或者已发展出了癌症的已经被HPV感染的那些人。本专利技术还涉及DNA表达载体，其能够有效地产生HPV16病毒的衣壳蛋白L2，以及还有与由人乳头瘤病毒引起的肿瘤的发展相关的病毒癌蛋白E6。特别地，本专利技术涉及通过基因克隆到表达载体中来获得重组的融合或杂合蛋白，其通过经由将一个或多个基因的核酸调控序列与一个或多个基因的蛋白质编码序列相组合而形成的融合基因的基因翻译来产生，其用于生成两种不同类型的应答：持久的体液免疫应答，其能够刺激针对HPV的特异性抗
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L2和抗
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E6抗体的产生(预防作用)，以及激活细胞免疫应答，以对抗已经建立的肿瘤细胞并且诱导细胞因子TNF(肿瘤坏死因子)的表达(治疗作用)。
[0002]专利技术背景
[0003]宫颈癌是全世界女性中第三最常见的癌症类型，其是女性中由癌症造成的死亡的第二主要原因。人群中两种最流行的病毒类型是在最具侵袭性的癌症中检测到的HPV16和HPV18。这些癌症主要由高风险HPV(人乳头瘤病毒)的持续感染引起(GUAN P,HOWELL
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JONESR,L]N等人,Human papillomavirus types in115,789HPV
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positive women:a meta
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analysis from cervical infection to cancer.Int J.第131卷,第2349
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2359页,2012)。
[0004]尽管有预防性疫苗可用，但是HPV感染在全世界仍然极为常见。据估计，目前宫颈癌在全世界影响着超过140万女性，导致每年超过30万名女性的死亡，主要影响发展中国家(WHO.Strategic Advisory Group of Experts(SAGE)on immunization WHO.World Health Organization,2017；DES,DIAZ M,等人,Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology:ameta
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analysis.Lancet Infect Dis,第7卷,第453
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459页,2007)。
[0005]在对于这种高死亡率负有责任的因素之中，疫苗的高成本和冷藏要求是最限制在发展中国家中施行大规模预防性免疫接种的因素，在发展中国家中发生大约87％的宫颈癌死亡(GLOBOCANE.Estimatedincidence,mortality and prevalence worldwide in 2012,v 1.0[internet,2012)。在私人诊所中，针对HPV的二价疫苗的价格为每剂大约200雷亚尔，而四价疫苗的价格为每剂大约300雷亚尔，每5至8年需要2至3个加强剂量(Cianciarullo AM.Profilaxia contra opapilomavirus humano.Rev.Sodebras,第9卷,第100期,第8
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15页,2014.在下述处可得:http://www.sodebras.com.br/edicoes/N100.pdf)。
[0006]今天，用于预防宫颈癌的主要形式是进行定期细胞学检查、巴氏涂片以及青春期
前女孩和男孩的预防性疫苗接种。在巴西，对于9至14岁的男孩和女孩，以及对于带有HIV或AIDS生活的9至26岁男性和女性、接受了器官和骨髓移植的患者和处于针对癌症的治疗中的人，最近由卫生部通过SUS(统一卫生系统)免费可获得四价的预防性疫苗(Cianciarullo AM.Profilaxia contra o papilomavirus humano.Rev.Sodebras,第9卷,第100期,第8
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15页,2014.在下述处可得:http://www.sodebras.com.br/edicoes/N100.pdf；INCA.2017.在下述处可得:http://portalsaude.saude.gov.br)。
[0007]老年人也可以使用该疫苗，但是所述疫苗仅在私人疫苗接种诊所中是可得的。它被指示用于9至45岁的女孩和女性，如果它是四价疫苗；或者大于9岁的任何年龄的女孩和妇女，如果它是二价疫苗；9至26岁的男孩和男性，用四价疫苗。另外，该疫苗可以被处于治疗中或已经具有HPV感染的人使用，因为它可以针对其他类型的HPV病毒进行保护，并且防止新的生殖器疣的形成和癌症的风险(参见Cianciarullo AM.Profilaxia contra o papilomavirus humano.Sodebras,第9卷,第100期,第8
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15页,2014.在下述处可得:http://www.sodebras.com.br/edicoes/N100.pdf；INCA.2017.在下述处可得:http://portalsaude.saude.gov.br)。
[0008]但是，此类作用旨在预防HPV感染，因为还没有针对已经建立的感染和损伤的特异性治疗。在由HPV所表达的蛋白质之中，我们突出L2和E6，它们是这项工作的靶标。L2蛋白存在于病毒衣壳中并且在不同类型的HPV之间是保守的，而E6是一种能够诱导被感染的细胞的恶性转化的致癌蛋白。完整的病毒基因组是恶性建立所需要的(Herrero R.,Gonz
á
lez P,Markowitz LE.Present status of human papillomavirus vaccine development and implementation.Lancet Oncol,第16卷,第e206
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216页,2015；Wang D,Li Z,Xiao J等人,Identification of broad
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genotype HPV L2 neutralization site for Pan
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HPV vaccine development by a cross
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neutralizing antibody.PLOS One,第10卷,第e0123944页,2015；Vande Pol SB,Klingelhutza J.Papillomavirus E6 oncoproteins.Virology,第445卷,第115
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137页,2013；Kims,Chungh,Kongh等人,Identi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】Tris，乙酸盐20mM，EDTA 1mM)中在0.8％(m/v)琼脂糖凝胶上进行电泳测定法，并且经历在Blue Green上样染料存在下的80V电泳走样。15.根据权利要求1的方法，其特征在于，在步骤(b)中，为了扩增所述载体，使用大肠杆菌细菌菌株DH5a和TOP10，其中将所述细菌菌株在37℃下在以250rpm的摇动下在3mL的Luria
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Bertani(LB)培养基(2％胰蛋白胨，1％酵母提取物，1％NaCl)中培养大约18小时，然后将该培养物的等分试样在包含加有1.5％琼脂的LB培养基的培养皿中进行划线，在37℃下温育大约18小时，其中选择一个菌落以接种3mL的LB培养基并且将其在与上面所描述的相同的条件下进行培养，在该时间段后，使用1mL的该培养物来接种100mL的LB培养基并且在37℃下在摇动下进行培养直至在600nm下所述培养物的光密度(OD600)达到0.4，其中所培养的细菌处于指数生长期的中间。16.根据权利要求15的方法，其特征在于，进行感受态的诱导，其中在达到所希望的细胞密度后，将细菌培养物转移至锥形管并且以5000xg离心10分钟并且在0.1M CaCl2溶液中在冰上温育1小时，然后将细菌再次进行离心并且重悬浮在加有10％甘油(w/v)的0.1M CaCl2溶液中，其中将200μL的等分试样冷冻于
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80℃直至使用。17.根据权利要求1的方法，其特征在于，从感受态细菌开始进行细菌转化的步骤(c)，其中将10μL的大约15g的质粒DNA和化学感受态细菌的等分试样的混合物在冰上温育30分钟，经历在42℃下的热休克2分钟，并且再次在冰上温育5分钟，然后添加350μL的S.O.C培养基(2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖)，将混合物在37℃下在250rpm的摇动下温育90分钟，然后将经转化的细菌接种在包含或不包含100μg/ml氨苄青霉素的LB
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琼脂培养基平板中并且在37℃下温育18小时。18.根据权利要求17的方法，其特征在于，在包含氨苄青霉素的LB
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琼脂培养基平板上生长出的菌落鉴定了通过菌落PCR而选择出的阳性克隆，并且将其接种在包含3mL的LB培养基的管中，在37℃下在摇动下温育大约18小时。19.根据权利要求1的方法，其特征在于，为了在转化后在步骤(d)中选择细菌菌落，使用菌落PCR技术，其中设计2种从L2E6基因序列开始合成的特异性引物，EAK03和EAK02，并且它们能够生成144bp的产物。20.根据权利要求19的方法，其特征在于，所述引物是由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的。21.根据权利要求19和20的方法，其特征在于，将所述引物以100μM的贮备浓度重悬浮在TE缓冲液(10mM Tris/HCl，1mM EDTA)中，其中对于PCR，在微量管中分开地制备每种溶液，所述微量管包含25μL的PCR
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Mix溶液(1.5mM MgCl2，0.5U Taq，5M dNTPs 200
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LGC Biotecnologia,Cotia,SP,Brazil)、0.5μL的25μM的每种引物和超纯水，以达到50μL的最终溶液体积。22.根据权利要求19至21的方法，其特征在于，作为模板DNA，使用每个经转化的细菌菌落的样品，在具有氨苄青霉素的LB培养基中进行选择和生长，其中在热循环仪中按照下述实验方案进行扩增：95℃5分钟，在95℃下1分钟、在56℃下30秒和在72℃下1分钟的25个循环，随后为在72℃下7分钟的最终延伸。23.根据权利要求19至22的方法，其特征在于，PCR产物的检测通过在0.5X TAE缓冲液中在0.8％琼脂糖凝胶中的电泳来进行，通过添加0.5μL的Blue Green上样染料I来制备样
品并且使其经历在80A下的走样30分钟。24.根据权利要求1的方法，其特征在于，在提取质粒DNA的步骤(e)中，将通过菌落PCR而选择出的阳性克隆在5mL的LB培养基中在选择抗生素存在下在37℃下在摇动下培养大约18小时，然后在环境温度下以12000xg离心1分钟以沉降出完整细菌。25.根据权利要求25的方法，其特征在于，为了纯化质粒DNA，使用GeneJet Plasmid Miniprep试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，其中将经纯化的DNA在0.5X TAE缓冲液中在0.8％琼脂糖凝胶中进行分析并且经历测序技术以确证目的基因插入到载体中，在分光光度计中进行定量，并且贮存于
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20℃。26.根据权利要求1的方法，其特征在于，在DNA测序的步骤(f)中，对质粒DNA样品进行测序以确证L2E6基因的正确插入及其完整性，其中通过分光光度法来定量从凝胶中纯化出的DNA样品，并且等分出5μL质粒的体积并且添加2.5μL的浓度为5μM的EAK03引物。27.根据权利要求1的方法，其特征在于，在步骤(g)中，使用转染试剂Transfection Reagents通过脂质转染法来进行HEK 293T细胞的瞬时转染，其中将所述转染试剂通过涡旋振荡与DMEM培养基的等分试样相混合，在环境温度下温育5分钟；以合适的比例向混合物添加目的质粒DNA，轻轻地均质化，并且在环境温度下温育15分钟，然后将培养基/转染试剂/DNA这一混合物添加至细胞与完全培养基，并且在恒温箱中在37℃和5％CO2下进行温育，其中在8小时后更换培养基，现在用包含抗生素和10％FBS的完全培养基，其中当收集细胞并且以免疫荧光和在SDS
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PAGE电泳凝胶中进行分析时，温育持续了大约48小时。28.根据权利要求27的方法，其特征在于，在步骤(g)中，对于293F细胞，转染测定法通过使用转染试剂293fectin来进行。29.根据权利要求1的方法，其特征在于，在步骤(h)中，将HEK293T细胞在12
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孔培养平板中在直径为13mm的圆形盖玻片上进行培养，其中将容易粘附的株系直接在盖玻片上在D10培养基中进行培养，保持在包含5％CO2的潮湿气氛中大约18小时。30.根据权利要求29的方法，其特征在于，在步骤(h)中，对于使用已经转染的293F细胞的测定法，将所述细胞在微量管中进行离心并且弃去上清液。31.根据权利要求29和30的方法，其特征在于，在转染后，将这两个细胞系都在PBS中洗涤2次并且在1％的在PBS中的低聚甲醛溶液中在4℃下固定1小时，其中在连续洗涤以去除...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：布坦坦研究所，
类型：发明
国别省市：