用于获得能够偶联一种或多种抗原的抗原呈递囊泡(APV)的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于获得能够偶联一种或多种抗原的抗原呈递囊泡(APV)的方法，其中这样的APV包含：(i)革兰氏阴性菌的外膜囊泡(OMV)；(ii)至少一种抗原性蛋白质或肽；和(iii)至少一对具有互补亲和力的分子，包括与囊泡缔合的第一亲和分子和与蛋白质或肽缔合的互补亲和分子。因此，本发明专利技术用于获得APV的方法对于实现由囊泡组成的呈递形式是至关重要的，这使得附接一种或多种蛋白质，或多种不同的蛋白质或肽抗原成为可能。就此而言，这样的方法包括以下步骤：(a)使第一亲和分子与囊泡(OMV)缀合；(b)获得与互补亲和分子融合的抗原蛋白质或肽；和(c)将步骤“b”中获得的融合蛋白与步骤“a”中获得的产物偶联。中获得的产物偶联。中获得的产物偶联。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于获得能够偶联一种或多种抗原的抗原呈递囊泡(APV)的方法


[0001]本专利技术属于用于医学目的的制剂的应用领域，更具体地，属于包含抗原或抗体的药物制剂领域，因为其涉及用于获得能够偶联一种或多种抗原的抗原呈递囊泡(APV)的方法，以用于制备免疫原性组合物，例如疫苗和免疫治疗化合物。

技术介绍

[0002]外膜囊泡(OMV)是由革兰氏阴性菌产生的结构。这些球形结构由革兰氏阴性菌的外膜及其周质形成。OMV与可溶性和不溶性蛋白质缔合并执行多种生物学功能。
[0003]鉴于在其表面存在脂多糖(LPS)和蛋白质，这些囊泡可以作为疫苗中的有效佐剂，并且还可以作为重要的载体。
[0004]通过了解这一点，本专利技术提出了一种用于获得抗原呈递囊泡(APV)的方法，所述囊泡包含免疫有效量的至少一种OMV、免疫有效量的至少一种抗原性蛋白质或肽、和至少一对具有互补亲和力的分子(例如，生物素或衍生物和对生物素具有亲和力的蛋白质)，从而获得能够偶联一种或多种抗原的抗原呈递囊泡(APV)，以用于制备免疫原性组合物，例如疫苗和免疫治疗化合物。
[0005]然而，现有技术中关于平常的缀合技术存在技术问题，其涉及对蛋白质的严格处理，这会导致一些困难，例如它增加了抗原蛋白质或肽变性和其他修饰的风险，以及囊泡的主要结构发生不必要的修饰/损坏。
[0006]为了解决现有的技术问题，本专利技术提出了一种出人意料地避免了抗原变性和其他修饰风险的方法，从而在保持所包含蛋白质的抗原性方面提供了实质性优势。
[0007]同样地，本专利技术的方法防止了囊泡主要结构的不必要的修饰/损坏，因为没有大量的化学插入：可以控制生物素化以与囊泡中的特定官能团反应。这种控制可以通过选择缀合试剂以及待使用的生物素或衍生物来完成。在一个实施方案中，活化剂分子EDAC与羧基反应，活化它们并使它们可用于与生物素衍生物的胺基缀合。由于唯一与OMV直接缀合的成分是生物素，因此不需要其他平行缀合方法，因为抗原始终对生物素具有亲和力。
[0008]现有技术描述了获得能够偶联一种或多种抗原的免疫治疗组合物的方法。
[0009]2017年8月22日公开的、以CHILDREN
’
S MEDICAL CENTER CORPORATION的名义、标题为APRESENTANDOEE USOS DOS MESMOS”的巴西专利申请号BR 11 2013 028887 6描述了一种包含免疫有效量的至少一种抗原性多糖、免疫有效量的至少一种肽或多肽抗原和至少一对互补亲和分子的免疫原性组合物，其用途和试剂盒。不同的是，本专利技术涉及一种用于获得抗原呈递囊泡(APV)的方法，该抗原呈递囊泡能够偶联一种或多种抗原，用于通过OMV的生物素化制备免疫原性组合物，例如疫苗和免疫治疗化合物，并且不使用文件BR 11 2013 028887 6中的抗原性多糖。重要的是要强调，该文件没有公开本专利技术提出的OMV的使用。
[0010]因此，没有现有技术文件描述或建议获得由革兰氏阴性菌的外膜囊泡(OMV)构成
的抗原呈递囊泡(APV)的方法，该囊泡能够偶联一种或多种抗原，用于制备免疫原性组合物，例如疫苗和免疫治疗化合物。

技术实现思路

[0011]本专利技术将在包含抗原或抗体的药物制剂领域提供显著优势。
[0012]在第一个方面，本专利技术涉及一种用于获得能够偶联一种或多种抗原的抗原呈递囊泡(APV)的方法，其中这样的APV包含：(i)革兰氏阴性菌的外膜囊泡(OMV)；(ii)至少一种抗原性蛋白质或肽；和(iii)至少一对具有互补亲和力的分子，包括与所述囊泡缔合的第一亲和分子和与所述蛋白质或肽缔合的互补亲和分子。
[0013]因此，本专利技术的用于获得APV的方法对于实现由囊泡组成的呈递形式是至关重要的，这使得附接一种或多种蛋白质，或多种不同的蛋白质或肽抗原成为可能。
[0014]在这方面，所述方法包括以下步骤：
[0015]a)使第一亲和分子(生物素或衍生物)与囊泡(OMV)缀合，任选地借助于活化剂分子；
[0016]b)使互补亲和分子(抗生物素蛋白或衍生物如rizavidin)与蛋白质抗原或肽遗传融合；和
[0017]c)将步骤“b”中获得的融合蛋白与步骤“a”中获得的产物偶联。
附图说明
[0018]本专利技术的结构和操作连同其附加优点可以通过参考附图和以下描述得到更好的理解。
[0019]图1表示使用重组抗原(rAg)组装APV复合物的代表性示意图的说明性图像。
[0020]图2A
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B以图形表示APV
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rAg复合物的纯化，在这种情况下，rAg为曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)蛋白rSmTSP
‑
2，其中(A)是分光光度计中对APV
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rSmTSP
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2复合物的凝胶过滤色谱级分的分析，并且(B)是用抗rSmTSP
‑
2抗体显示的构成峰A的级分的蛋白质印迹。
[0021]图3A
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D表示APV
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rSmTSP
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2复合物的生物物理表征，其中(A)是从乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)中分离的OMV的透射电子显微镜(TEM)图像；(B)是脱毒OMV的TEM图像；(C)是APV
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rSmTSP
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2复合物的TEM图像，其中右角的尺寸条标示在每个图像上；以及(D)是从乳糖奈瑟球菌中分离的OMV、脱毒OMV和APV
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rSmTSP
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2复合物的尺寸分布曲线。
[0022]图4以图形表示在2或3剂APV
‑
rSmTSP
‑
2后刺激的脾细胞上清液中细胞因子的产生。
[0023]图5以图形表示来自用APV
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rTSP
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2免疫的小鼠的T
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CD4+和T
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CD8+细胞的细胞因子产生。
[0024]图6A
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B以图形表示用rSmTSP
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2或APV
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rSmTSP
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2免疫的小鼠中针对rSmTSP
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2蛋白的IgG体液反应，其中(A)表示免疫小鼠中抗rSmTSP
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2IgG抗体的剂量，并且(B)是用rSmTSP
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2或APV
‑
rSmTSP
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2免疫的组中的IgG1和IgG2c同种型。
具体实施方式
[0025]尽管本专利技术可能有不同的实施方案，但附图和下面的详细讨论显示了优选实施方案，应理解本实施方案被认为是对本专利技术原理的示例，而不是旨在将本专利技术限制在本报告中说明和描述的范围内。
[0026]本专利技术涉及一种用于获得能够偶联一种或多种抗原的抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于获得能够偶联一种或多种抗原的抗原呈递囊泡(APV)的方法，其特征在于它包括以下步骤：a)使第一亲和分子与囊泡(OMV)缀合；b)获得与一种或多种抗原蛋白质或肽融合的互补亲和分子；和c)将步骤“b”中获得的融合蛋白与步骤“a”中获得的产物偶联，其中获得的APV包含：
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革兰氏阴性菌的外膜囊泡(OMV)；
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至少一种抗原性蛋白质或肽；和
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至少一对具有互补亲和力的分子，包括：(i)与所述囊泡结合的第一亲和分子；和(ii)与所述蛋白质或肽融合的互补亲和分子。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤“a”中，所述OMV与所述第一亲和分子的缀合反应在添加有3％蔗糖的合适溶液中进行，其中OMV以相对于第一亲和分子为1:1至1:10(质量/质量)的比例添加，其中使用的所述合适溶液取决于使用的缀合类型，并且选自由以下组成的组：不含缀合干扰剂的缓冲液，优选不含Ca
2+
/Mg
2+
的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)或生理盐水(150mM NaCl水溶液)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，仍在步骤“a”中，将混合物在4℃至25℃的温度保持4至18小时，其中所述混合物随后用添加了3％蔗糖的先前使用的所述合适溶液进行渗析，以消除过量的未结合的所述第一亲和分子。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤“a”中，任选地使用0.05M至0.2M的活化剂分子。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤“a”中，这样的OMV来自选自由脑膜炎奈瑟球菌血清群B或乳糖奈瑟球菌组成的组的细菌，其中优选地所述OMV来自乳糖奈瑟球菌N.285/03。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，仍在步骤“a”中，这样的第一亲和分子选自由生物素、生物素衍生物或生物素模拟物组成的组，优选胺
‑
PEG3
‑
生物素((+)
‑
生物素基
‑3‑
6,9
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三噁十一烷二胺)或其衍生物或功能片段，更优选生物素。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，仍在步骤“a”中，这样的活化剂分子选自由代表性偶联剂，包括有机化合物，例如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺组成的组，其中优选地这样的活化剂分子是EDAC(1
‑
乙基
‑3‑
[3

【专利技术属性】
技术研发人员：梅拉，
申请(专利权)人：布坦坦研究所，
类型：发明
国别省市：