对五种输入性疟原虫分型检测的引物、探针及方法技术

本发明专利技术公开了一种对五种输入性疟原虫分型检测的引物、探针及方法。所述五种输入性疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫，所述引物包括8条引物，所述探针包括2条探针。本发明专利技术基于多重PCR，利用不对称扩增方法扩增出大量的带有特定标签序列的长链单链DNA产物，结合通用型二维标记探针介导的熔解曲线分析技术，实现单管/闭管双通道的5种疟原虫快速检测及分型。同时，亦可通过内标指示体系正常与否及标本采集质量。检测体系5个检测对象检测下限均为10拷贝数/反应，体系特异性好，选择能力强。该方法有助于输入性疟原虫快速检测和分型，对外防输入疟疾和保持沿海经济持续发展具有重要意义。和保持沿海经济持续发展具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
对五种输入性疟原虫分型检测的引物、探针及方法


[0001]本专利技术涉及生物医学工程领域，特别涉及一种对五种输入性疟原虫分型检测的引物、探针及方法。
技术背景
[0002]疟疾是一种由疟原虫寄生于人体引起的急性发热性疾病，主要通过受感染的按蚊叮咬或经输血、母婴传播，是目前全球广泛关注的三大疾病之一。因发作时患者会感觉“发冷”、全身发抖，俗称“打摆子”。据估计，2017年，疟疾已遍及全球90多个国家和地区，约有2.19亿人患有疟疾，并有超过43.5万人因此死亡，其中绝大多数来自于非洲地区。在美国，每年约有1700例疟疾，以从南非、南亚为主的高危疟疾传播国家返回的旅行者和移民居多。2021年6月30日，世界卫生组织宣布中国获得无疟疾认证，标志着中国再没有疟疾本土病例。随着我国国际化进程不断加快，出国人员逐渐增加，境外输入已成为中国疟疾的主要来源方式。
[0003]疟原虫进入人体后在肝脏中繁殖，继而感染并破坏血红细胞，不断繁殖、不断破坏，导致人体发病。症状主要表现为周期性规律发作，全身发冷、发热、多汗，长期多次发作后，可引起贫血和脾肿大。凶险型疟疾可出现因脑、肝、肾、心、肺、胃、肠等受损引起的各种综合征，病情严重者会出现谵妄、昏迷和休克等症状，如诊断不及时或治疗不当，可危及生命。对包括无症状的寄生虫携带者进行早期准确诊断对于有效的疾病管理至关重要。同时，为达到全球根除疟疾目标，从根本上中断疟疾传播，敏感的诊断测试在提供准确的流行病学信息以指导做出相应的变化具有重要的作用。
[0004]长期以来人们认识到自然界中有四种疟原虫感染人类，包括：恶性疟原虫，间日疟原虫，卵形疟原虫和三日疟原虫。近年来，几乎所有的东南亚国家都有报道诺氏疟原虫（Plasmodium knowlesi）感染的疟疾病例，越来越多的证据表明，诺氏疟原虫已成为该地区主要的疟原虫种类。诺氏疟原虫是一种自然感染东南亚猕猴的高致病性疟疾寄生虫，也会感染人类，导致从动物传染给人类的疟疾（“人畜共患”疟疾），具有低致热阈值、成年人感染的严重致病风险至少与感染恶性疟原虫的相一致，通过镜检难以区分，常被误诊为恶性疟原虫或间日疟原虫，其真实发病率远远被低估。据报道，在马来西亚，许多病例因未提早认识到诺氏疟原虫致病而误诊，导致用药延迟，死亡率很高。因此，提高对诺氏疟原虫的认识并及早准确诊断，有助于临床医生提供最佳的治疗方案，据估计可降低诺氏疟原虫疟疾病死率六倍，有助于改善对这种新型寄生虫的监测。
[0005]目前可用于鉴定疟原虫属的诊断工具包括病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断法。病原学检查是病原体确诊的“金标准”，包括涂片染色法、动物接种分离法或细胞培养法查找虫体等。血清诊断已成为当今广泛应用的诊断手段，方法种类较多，主要有间接血凝试验（IHA）、间接免疫荧光试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）以及免疫色谱侧向流动测定（又称为快速诊断测试，RDT）。但病原学、血清学检测方法存在耗时较长，灵敏度低，甚至敏感的RDT也与显微镜具有相似的局限性，对病原体繁殖不活跃或者潜伏期感染
的样本，有漏检的风险。已有资料证明因检测灵敏度不够无法筛查出感染了恶性疟原虫的无症状携带者。同时，上述检测方法检测通量低，难以实现自动化结果分析，不同寄生虫间存在交叉反应性等因素均有可能影响检测结果。分子生物学技术核酸检测诊断为病原生物的检测提供了快速、高效、灵敏的诊断新方法。PCR技术以其高敏感性、高特异性等特点，被广泛应用于生命科学的各个领域。Okell等人发现，对于恶性疟原虫，与PCR相比，显微镜检测低估了50.8％的患病率，并且这种差异在低传播环境中变得更加显着。现已有应用于多种血液寄生虫的核酸检测报道，并显示出较高的敏感性和较强的特异性。如PCR
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电泳，PCR
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酶联免疫吸附测定（PCR
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ELISA），巢式PCR
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高分辨率熔解分析（nPCR
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HRM）等。其中，Kimura 等人以SSU rRNA为靶基因建立的巢式PCR是截止到目前最受广泛应用于恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟的标准检测方法。在该方法中，用针对来自疟原虫物种的小亚基rRNA基因的保守序列设计通用引物进行第一次PCR，然后用针对来自每种人类疟原虫物种的特定基因序列设计内部引物进行第二次PCR。该方法具有良好的分析灵敏度，但PCR扩增步骤繁琐，需要多次开盖操作，容易因受污染而产生假阳性。2004年，Mathieu等人以18S rRNA为靶基因开发了一个三管的多重实时PCR检测上述4种疟原虫，该方法虽说避免了开管检测，但通量低，采用多管检测加大了样本需求量和试剂成本，操作仍较多。同时，已报道以18S rRNA为靶基因的PCR方法容易在诺氏疟和间日疟发生交叉反应。近年来，国内外新兴了一些快速检测疟原虫的方法，如LAMP检测诺氏疟、恶性疟和间日疟，RPA检测诺氏疟原虫。但这些方法均存在检测通量低，引物探针设计困难等缺点。
[0006]探针熔解曲线分析技术（Probe melting curve analysis，PMCA）是通过实时监测温度变化过程中，因探针与靶序列杂交形成的熔点（即Tm值）不同而导致荧光强度的变化，得到的荧光强度随着温度变化的曲线，即探针熔解曲线。它是一种后PCR检测技术，在完成PCR程序后添加一个温度梯度的荧光检测步骤，不需要重新开管检测和更多的人工操作。可根据Tm值的差异区分不同的靶序列或检测同一靶序列的多位点组成信息，若同时使用不同荧光基团标记的探针，就能实现多色荧光检测，将两者结合就可以大大提高单个反应同时检测多个靶序列数目的能力。
[0007]本研究通过引入固定荧光探针，采用特异性引物对不对称扩增不同型别疟原虫，其中，限制性引物包含5
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端为因与荧光探针不同杂交程度而具有不同Tm值的靶序列、3
’
端为特异性引物序列的较长链寡核苷酸，利用PCR扩增和闭管模式的探针熔解曲线分析实现常见输入疟原虫的快速诊断和分型。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种对五种输入性疟原虫分型检测的引物、探针及方法。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术首先提供了对五种输入性疟原虫分型检测的引物和探针，所述五种输入性疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫，所述引物包括8条引物，所述探针包括2条探针；所述8条引物为：用于特异扩增恶性疟原虫的限制性引物Pf
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用于特异扩增间日疟原虫的限制性引物Pv
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；用于特异扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.对五种输入性疟原虫分型检测的引物和探针，其特征在于：所述五种输入性疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫，所述引物包括8条引物，所述探针包括2条探针；所述8条引物为：Pf
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；所述2条探针为：U1：5
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘小龙，许海坡，汤优，曾永毅，赵必星，蔡志雄，周阳，
申请(专利权)人：福建医科大学孟超肝胆医院福州市传染病医院，
类型：发明
国别省市：