一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒。包括至少两组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。具体引物如SEQ ID NO.1～16所示。本申请能够同时针对四种利什曼原虫特异DNA片段开展利什曼原虫高通量检测，灵敏度为100％，特异性为99.42％，准确性可达99.55％，可以缩短检测时间，提高检测效率。提高检测效率。

【技术实现步骤摘要】
一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]利什曼原虫病(Leishmaniasis)被世界卫生组织界纳入五大寄生虫病之列，由利什曼原虫(Leishmania spp)引起，致病性复杂，广泛分布于亚、欧、非、拉丁美洲等地。全世界每年有150万—200万人感染利什曼原虫病，大约80多个国家报告过利什曼原虫病，对3.5亿健康人群产生威胁。我国利什曼原虫病的发病率较低，维持在0.0372/10万的水平，主要是散发病例。国内对利什曼原虫快速检测方面开展的研究工作较少，缺乏快速检测的PCR商品化试剂。我国境外技术和劳务人员工作主要目的地，利什曼原虫病疫情不断出现，我国在多个入境口岸监测到疑似感染利什曼原虫的归国劳务人员。国内外疫情状况的差别，使得境外劳务人员感染利什曼原虫病后，入境时面临没有利什曼原虫检测试剂的局面，对病例后期诊断、救治等工作造成了很大困难。因此建立利什曼原虫高通量检测技术，第一时间确定感染利什曼原虫种类，是提高口岸防控利什曼原虫病效率的根本保证。

技术实现思路

[0003]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物及方法和试剂盒，本申请能够同时针对四种利什曼原虫特异DNA片段开展利什曼原虫高通量检测，可以缩短检测时间，提高检测效率。
[0004]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0005]一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物，包括至少两组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。
[0006]进一步地，引物包括至少四组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。
[0007]进一步地，引物如SEQ ID NO.1～16所示。
[0008]进一步地，利士曼原虫为杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫。
[0009]一种基于多重串联式PCR基因碟片检测利士曼原虫的方法，包括以下步骤：
[0010](1)提取待检样品DNA；
[0011](2)采用上述引物中的内引物制备基因碟片，备用；
[0012](3)采用上述引物中的外引物进行第一轮PCR扩增，然后再以第一轮扩增产物为模板，采用基因碟片进行第二轮PCR扩增即可。
[0013]进一步地，待检样品为含有杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫中至少一种基因的质粒标准品。
[0014]进一步地，基因碟片的制备过程为：
[0015]取11μL内引物，将其加入到扩增反应板中，调整浓度，使最终浓度达到0.4μmol/L。然后将扩增反应板放置于
‑
50℃的条件下干燥处理20min，再使用封口膜封闭扩增反应板，最后将扩增反应板放置于4℃的条件下备用。
[0016]进一步地，第一轮PCR扩增反应体系包括：0.3μL Mix1、20ng核酸模板、0.2μmol/L外引物混合物，25μL Mix2，最后用ddH2O补足至50μL；
[0017]扩增程如下：95℃预变性10min；94℃变性30s；58℃退火60s；72℃延伸60s，共20个循环；最后72℃延伸1min。
[0018]进一步地，第二轮PCR扩增反应体系包括：检测试剂56μL、第一轮PCR产物稀释物4.5μL、ddH2O 52μL，均匀混合后，向基因碟片的扩增反应板中加入混合物，每孔25μL；
[0019]扩增程序如下：95℃预变性10min；94℃变性10s，54℃退火10s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸1min。
[0020]一种用于检测利士曼原虫的试剂盒，包括上述引物。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022]本申请构建了4种利士曼原虫含有的ITS
‑
1、ITS
‑
2、P0、RACK目的基因片段重组质粒模板，设计引物，通过溶解温度差异直接区分四个基因群组，四个基因群组的扩增曲线差异明显，能够特异性检测四种利什曼原虫，特异性强。ITS
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1、P0、ITS
‑
2和RACK4个基因的检测限均可达到103copies/μL，检测限与GeXP多重基因检测技术在猪常见高致死病原检测中的检测限一致，检测结果清晰准确。针对4种利什曼原虫检测的灵敏度为100％，特异性为99.42％，准确性为99.55％。
[0023]本申请基于MT
‑
PCR技术，建立了杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、热带利什曼原虫和硕大利什曼原虫高通量检测技术，一次性检测4种利士曼原虫，具有较高特异性和灵敏度。本研究建立的检测技术，可应用于口岸一线对入境旅客利什曼原虫的快速检测，能在第一时间确定病原体或者缩小筛查范围，对病例及时救治和疫情快速控制具有重要意义。
附图说明
[0024]图1为检测杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫的扩增曲线和溶解曲线；
[0025]图2为ITS
‑
1、P0、ITS
‑
2、RACK基因的扩增曲线和溶解曲线；
[0026]图3为混合感染模型的灵敏度和重复性检测结果。
具体实施方式
[0027]下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。
[0028]主要试剂
[0029]脱氧核糖核酸提取试剂：Wizard Genomic DNA purification Kit(Promega，A1120)，基因扩增检测试剂：SYBR Premix Ex Taq(Takara,DRR041A)，多基因扩增检测试剂：MμLtiplexPCR Assay Kit(Takara,RR062B)。主要仪器：真空冷冻干燥仪：Eppendorf，
concentrator plus，核酸提取仪：赛默飞FLEX,荧光定量PCR仪：罗氏480。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0030]实施例1引物设计
[0031]针对4种不同类型什曼原虫，构建4个分别含有ITS
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1、ITS
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2、P0、RACK目的基因片段的阳性重组质粒模板，提取质粒DNA保存于
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80℃超低温冰箱。检索基因序列(GenBank accession no:AF306777，JN673394，JN673389，JN673385，AB175625，AY297458，AF499109和M12691)，使本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对利士曼原虫进行多重串联式PCR基因碟片检测的引物，其特征在于，包括至少两组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物包括至少四组引物，每组引物包括一对外引物和一对内引物。3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO.1～16所示。4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，所述利士曼原虫为杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫。5.一种基于多重串联式PCR基因碟片检测利士曼原虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待检样品DNA；(2)采用权利要求1～3任一项所述引物中的内引物制备基因碟片；(3)采用权利要求1～3任一项所述引物中的外引物进行第一轮PCR扩增，然后再以第一轮扩增产物为模板，采用基因碟片进行第二轮PCR扩增即可。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待检样品为含有杜氏利士曼原虫、婴儿利士曼原虫、热带利士曼原虫和硕大利士曼原虫中至少一种基因的质粒标准品。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因碟片的制备方法为：将各内引物，分别成对加入到扩增反应板中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：高国龙，常晓松，何纬，邓晓东，张青，刘杨，
申请(专利权)人：四川国际旅行卫生保健中心成都海关口岸门诊部，
类型：发明
国别省市：