EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提出EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法，该引物探针组合包括EHP上游引物、EHP下游引物和EHP探针；所述EHP上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述EHP下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述EHP探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述EHP探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM。采用上述引物探针组合的检测方法和试剂盒能够实现高灵敏度、高特异性的EHP检测，为对虾肝肠胞虫病的早检测早防控提供条件。提供条件。提供条件。

【技术实现步骤摘要】
EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物病原检测
，尤其涉及EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]对虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)2009年首次在泰国生长缓慢的养殖斑节对虾中被分离并命名，是一种高传染性细胞内寄生的微孢子虫，近年来在泰国、印度、越南、马来西亚、印度尼西亚和中国等主要对虾养殖国家中流行，主要感染凡纳滨对虾和斑节对虾等养殖虾类。该病原具有非常强的传染性，可通过多途径传播，能在虾的消化器官细胞内大量繁殖，吸收营养，从而影响肝胰腺和肠道的正常消化吸收功能，使被寄生的虾类生长发育受阻碍，严重时可导致其生长停止。EHP属于胞内寄生的微孢子虫，且形成的孢子可以在各种恶劣的环境中休眠，在环境适宜的条件下又重新复活侵染宿主，极难清除，没有有效的治疗手段和药物，目前只能采取在亲虾的筛选、虾苗的培育和对虾的标粗、养殖过程中实时监测的措施来降低风险，减少损失，而国内外关于EHP的生活史、致病机理和导致该病爆发的因子等方面的研究几乎是空白，也没有有效的控制和预防该病的方法，在养殖生产过程中人们对于EHP的发生、爆发和蔓延仍束手无策。专利技术人的团队在对虾肝肠胞虫病的调查中发现：一些池塘的对虾从放苗开始直至养成的各阶段EHP抽检结果都显示阳性，但其体长体重指标仍符合正常对虾生长曲线，没有出现生长缓慢或生长停滞等现象；而一些池塘的对虾EHP检测结果为阳性，当生长至3
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5cm的时候就不再继续长大。由此推测，对虾肝肠胞虫疾病的爆发可能与虾体内EHP的载量相关，且也已经有相关文献报道了对虾体内EHP的载量与虾体长体重呈现负相关。
[0003]因此，建立快速灵敏实用的EHP定量检测技术，不仅能及时预报预测该病原所致病害的发生，同时也是今后加强科学养殖管理，提出防控措施所必须的。然而，目前对虾疾病的检测技术如现场目视观察法、光学显微镜检查法、电子显微镜检查法、免疫荧光检查法、分子生物学法等均存在局限性，不能达到理想的检测要求，且仅是用于EHP的定性检测，不能定量。PCR技术检测灵敏度高，特异性强，检测周期短，操作相对简便，目前已广泛应用于对虾肝肠胞虫病的检测。特别是Tagman荧光定量PCR技术提供了病原定量检测的新途径。
[0004]但是，目前报道的EHP的Tagman定量检测产品和检测方法的灵敏度和特异性还不能满足检测需要。高灵敏度、高特异性的EHP检测方法是有效控制对虾肝肠胞虫病传播，避免疫病大面积爆发的基础和前提，也是各级水生动物疫病防控机构、科研机构以及大规模对虾养殖场对该病监测、检疫的迫切需要。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对上述技术问题，提出EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法，能够实现高灵敏度、高特异性的EHP检测，为对虾肝肠胞虫病的早检测早防控提供条件，同时也为水生动物疫病防控提供了技术保障，对保障我国对虾养殖业健康发展具有
重要意义。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术第一方面提供了一种EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合，包括EHP上游引物、EHP下游引物和EHP探针；所述EHP上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述EHP下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述EHP探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述EHP探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM。
[0007]本专利技术第二方面提供了一种EHP实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述的引物探针组合。
[0008]作为优选，该试剂盒还包括无菌无酶水、PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。
[0009]作为优选，所述阳性对照品为重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57
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SSU。
[0010]作为优选，所述阴性对照品为DEPC水。
[0011]作为优选，所述PCR反应液包括TagD NA聚合酶、dNTPs和缓冲液。
[0012]本专利技术第三方面提供了采用上述试剂盒的EHP实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
[0013](1)设计、合成引物和探针：根据GenBank(登录号：FJ496356.1)中公布的对虾肝肠胞虫SSU基因序列的分析比对，设计引物和荧光探针；其中，EHP上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EHP下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，EHP探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述EHP探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM；
[0014](2)制备对照品：制备重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57
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SSU作为阳性对照品，以DEPC水作为阴性对照品；
[0015](3)EHP荧光定量PCR扩增：提取待测样品DNA，使用步骤(1)中设计的引物与探针，以待测样品DNA为模板，对待测样品进行Tagman荧光定量RT
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PCR扩增反应；
[0016](4)结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，判定待测样品阳性或阴性。
[0017]作为优选，所述步骤(2)的阳性对照品制备方法为：使用EHP
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SSU质粒扩增上游引物：5'
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GCGGTCCATGATGGCAGC
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3'和下游引物：5'
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ATACGGTTATTTAA
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3',以对虾肝肠胞虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增，所得PCR产物经回收后与pUC57载体连接，以构建重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57
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SSU，作为阳性对照品。
[0018]作为优选，所述步骤(2)的扩增反应体系为：上游引物(10μmol)1μl；下游引物(10μmol)1μl；模板1μl；2
×
Premix Tag buffer 12.5μl；DEPC水9.5μl，总体积为25μl。
[0019]作为优选，所述步骤(2)的扩增反应条件为：95℃5min；95℃30s，58℃50s，72℃1min，共30个循环；72℃7min，4℃保存。
[0020]作为优选，所述步骤(3)的扩增反应体系为：EHP上游引物(10μmol)0.5μL；EHP下游引物(10μmol)0.5μL；EHP探针(10μmol)1μL；模板2μL；2
×
Probe PCR buffer Mix 12.5μL；DEPC水8.5μL，总体积为25μL。
[0021]作为优选，所述步骤(3)的扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环，在每一循环退火结束时收集FAM荧光信号。
[0022]作为优选，所述步骤(4)的检测结果的判定标准为：待检样品Ct值≤38，判为对虾肝肠胞虫核酸阳性，待检样品Ct值＞40本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合，其特征在于，包括EHP上游引物、EHP下游引物和EHP探针；所述EHP上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述EHP下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述EHP探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述EHP探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM。2.权利要求1所述的EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合在制备EHP检测产品中的应用。3.一种EHP实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合。4.根据权利要求3所述的EHP实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括无菌无酶水、PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。5.根据权利要求4所述的EHP实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57
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SSU，所述阴性对照品为DEPC水。6.一种EHP实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，采用权利要求3至5中任一项所述的试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：(1)设计、合成引物和探针：根据GenBank中公布的对虾肝肠胞虫SSU基因序列的分析比对，设计引物和荧光探针；其中，EHP上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EHP下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，EHP探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述EHP探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM；(2)制备对照品：制备重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57
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SSU作为阳性对照品，以DEPC水作为阴性对照品；(3)EHP荧光定量PCR扩增：提取待测样品DNA，使用步骤(1)中设计的引物与探针，以待测样品DNA为模板，对待测样品进行Tagman荧光定量RT
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PCR扩增反应；(4)结果检...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙妍，魏俊利，陈浩楠，董学旺，刘群，
申请(专利权)人：天津市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：