用于虾肝肠胞虫分离纯化、染色及计数的方法技术

本发明专利技术公开了用于虾肝肠胞虫分离纯化、染色及计数的方法。该方法包括以下步骤：制样：解剖感染虾肝肠胞虫的对虾肝胰腺和肠道组织，制成组织匀浆液用无菌生理盐水稀释得稀释匀浆液；粗提：采用差速离心法将所得稀释匀浆液制成肝肠胞虫粗提液；粗提步骤中所用洗涤介质包括丙三醇；提纯：采用不连续蔗糖密度梯度离心法对步骤S2所得肝肠胞虫粗提液进行分离提纯，得纯化的肝肠胞虫悬浮液；染色：采用荧光增白剂对所得纯化的肝肠胞虫悬浮液中的肝肠胞虫进行染色；计数：将染色后的肝肠胞虫过滤到黑色核孔滤膜上，在荧光显微镜高倍镜下进行观察计数。该方法具有操作简便、成本低廉、病原纯度高、染色剂特异性强，计数准确的优点。计数准确的优点。计数准确的优点。

【技术实现步骤摘要】
用于虾肝肠胞虫分离纯化、染色及计数的方法


[0001]本专利技术涉及寄生虫研究
，具体涉及用于虾肝肠胞虫分离纯化、染色及计数的方法。

技术介绍

[0002]虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)属于微孢子虫科、肠胞虫属，是一种高传染性细胞内寄生的微孢子虫，于2009年首次在泰国生长缓慢的养殖斑节对虾(Penaeusmonodon)的肝胰腺小管上皮细胞中被分离并命名，近年来在泰国、印度、越南、印度尼西亚和中国等主要对虾养殖国家中传播流行，主要感染凡纳滨对虾(Penaeusvannamei)和斑节对虾等养殖虾类。该病原能在虾的消化系统细胞内大量繁殖，吸收营养，从而影响肝胰腺和肠道的正常消化吸收功能，可造成对虾生长极其缓慢或停滞，严重影响对虾产量和经济价值，是危害全球对虾养殖产业的重要病害之一。
[0003]EHP属于细胞内寄生的微孢子虫，传播力强，预防难度大，没有有效的治疗手段和药物。至今国内外关于EHP的生活史、致病机理和导致该病爆发的因子等方面的研究几乎是空白，因此开展针对该病原的防治技术研究举步维艰。究其原因主要是由于肝肠胞虫个体微小，粒径仅1μm左右，且无法实现体外增殖，导致研究所需的高纯度病原体无法大量获得，严重影响了对该病原开展深入研究的进程。因此，很多研究人员试图从患病对虾体内分离获得高纯度肝肠胞虫，但是，现有的虾肝肠胞虫分离纯化方法，存在缺乏技术细节、重复性差、病原体获得纯度不高、杂质含量多等缺点，同时现有研究手段也缺少针对孢子虫类病原体的特异性染色和较为精确的计数方法，既不能在镜下有效地区分杂质与肝肠胞虫，也无法对提取方法的效果和数量进行评价。因此，亟待建立一种针对虾肝肠胞虫的分离纯化、染色及计数的方法来解决上述问题，从而能够加速推进EHP防控技术的研究。

技术实现思路

[0004]针对现有技术不足，本专利技术要解决的技术问题是，提供用于虾肝肠胞虫分离纯化、染色及计数的方法。该方法可高效分离提取到高纯度的对虾肝肠胞虫，并能快速有效的区分对虾肝肠胞虫与其他微生物，从而方便、准确的实现对虾肝肠胞虫计数。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术公开了一种用于虾肝肠胞虫分离纯化、染色及计数的方法，包括以下步骤：
[0006]制样：低温解剖感染虾肝肠胞虫的对虾肝胰腺和肠道组织，制成组织匀浆液用无菌生理盐水稀释得稀释匀浆液；
[0007]粗提：采用差速离心法将所得稀释匀浆液制成肝肠胞虫粗提液；粗提步骤中所用洗涤介质包括丙三醇；
[0008]提纯：采用不连续蔗糖密度梯度离心法对步骤S2所得肝肠胞虫粗提液进行分离提纯，得纯化的肝肠胞虫悬浮液；
[0009]染色计数：采用荧光增白剂对所得纯化的肝肠胞虫悬浮液中的肝肠胞虫进行染
色，并将染色后的肝肠胞虫过滤到黑色核孔滤膜上，在荧光显微镜高倍镜下进行观察计数。
[0010]作为优选，所述制样步骤包括：低温解剖重度感染肝肠胞虫的对虾肝胰腺和肠道组织，使用组织匀浆机或玻璃匀浆器研磨至无明显组织块，抽取5～10ml组织匀浆液用无菌生理盐水稀释至30～35ml，得稀释匀浆液。
[0011]作为优选，所述粗提包括以下步骤：
[0012]S2：将稀释匀浆液在4℃，600r/min离心10min，吸取上清液备用；向沉淀物中再加入无菌生理盐水至15～20ml，重悬；
[0013]S3：将步骤S2所得的重悬液体在4℃，600r/min离心10min，吸取上清液，并与步骤S2所得上清液混合得混合上清液；
[0014]S4：向步骤S3所得混合上清液中加入丙三醇，丙三醇与上清液按体积比1:3进行混合，在4℃，8000r/min离心30min，弃上清；沉淀物用20～25ml无菌生理盐水以4℃，6000r/min离心10min的条件离心清洗三次；
[0015]S5：将步骤S4所得沉淀物用3～5ml无菌生理盐水重悬，得肝肠胞虫粗提液。
[0016]作为优选，所述提纯包括以下步骤：
[0017]S6：按照蔗糖溶液浓度由小到大的顺序，使用加长针头依次注入离心管最底部，每种浓度蔗糖溶液的注入量为1.5～2ml；
[0018]S7：使用移液器缓慢加入1.5ml肝肠胞虫粗提液于蔗糖梯度液面最顶部，保证样品与最上层蔗糖溶液不混溶，接液面清晰可见；
[0019]S8：将步骤S7配制好的蔗糖密度梯度离心液使用水平转子在4℃，2000r/min离心30min；
[0020]S9:采用注射器从上至下吸取梯度分界处白色条带于离心管中，在4℃，6000r/min离心10min，弃上清，所得沉淀物用5～10ml无菌生理盐水以4℃，6000r/min离心10min的条件离心清洗三次，得到纯化的肝肠胞虫悬浮液。
[0021]作为优选，所述步骤S6中注入蔗糖溶液的速度为1ml/min，所述步骤S6的总用时≤15min；所述步骤S6中使用了五种浓度的蔗糖溶液，其浓度分别为20％、25％、30％、35％、40％；各浓度蔗糖溶液的配制方法分别为：
[0022]20％蔗糖溶液：称取20g蔗糖，用去离子水定容至100ml；
[0023]25％蔗糖溶液：称取25g蔗糖，用去离子水定容至100ml；
[0024]30％蔗糖溶液：称取30g蔗糖，用去离子水定容至100ml；
[0025]35％蔗糖溶液：称取35g蔗糖，用去离子水定容至100ml；
[0026]40％蔗糖溶液：称取40g蔗糖，用去离子水定容至100ml。
[0027]作为优选，所述步骤S9为采用注射器吸取由上向下数，第三条乳白色条带于离心管中，4℃，6000r/min离心10min，弃上清，沉淀物用无菌生理盐水以4℃，6000r/min离心10min的条件离心清洗三次，得到纯化的肝肠胞虫悬浮液。
[0028]作为优选，所述步骤S7中加入肝肠胞虫粗提液的方法为在铺制好梯度的液面最顶部，将移液器吸头紧贴离心管内壁，使吸头与管壁成80～90
°
，以1ml/min的速度加入1.5ml粗提液，保证样品与最上层蔗糖溶液不混溶，接液面清晰可见。
[0029]作为优选，所述荧光增白剂为CalcofluorWhiteM2R染色液，Calcofluor WhiteM2R染色液的配制方法为：称取1g的CalcofluorWhiteM2R染色剂用100mlpH值为7.2的TBS缓冲
液溶解，使之浓度为1％(W/V)，再加入0.1g的Evan
’
sblue染料，于4℃暗处储存；使用前经12000rpm/min离心5min，取上清液使用。
[0030]作为优选，所述计数包括以下步骤：
[0031]1)取0.22μm黑色核孔滤膜，用无菌水漂洗干净；黑色核孔滤膜光面朝上，平贴于滤器底部，使黑色核孔滤膜上下不留气泡，然后在水平台面上安好滤器，用夹子夹紧，使滤器处于水平状态；
[0032]2)预先在滤筒内加入5ml无菌水，吸取肝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于虾肝肠胞虫分离纯化、染色及计数的方法，其特征在于，包括以下步骤：制样：解剖感染虾肝肠胞虫的对虾肝胰腺和肠道组织，制成组织匀浆液用无菌生理盐水稀释得稀释匀浆液；粗提：采用差速离心法将所得稀释匀浆液制成肝肠胞虫粗提液；粗提步骤中所用洗涤介质包括丙三醇；提纯：采用不连续蔗糖密度梯度离心法对步骤S2所得肝肠胞虫粗提液进行分离提纯，得纯化的肝肠胞虫悬浮液；染色计数：用荧光增白剂对所得纯化的肝肠胞虫悬浮液中的肝肠胞虫进行染色，并将染色后的肝肠胞虫过滤到黑色核孔滤膜上，在荧光显微镜高倍镜下进行观察计数。2.根据权利要求1所述的用于虾肝肠胞虫分离纯化、染色及计数的方法，其特征在于，所述制样步骤包括：低温解剖重度感染肝肠胞虫的对虾肝胰腺和肠道组织，使用组织匀浆机或玻璃匀浆器研磨至无明显组织块，抽取5～10ml组织匀浆液用无菌生理盐水稀释至30～35ml，得稀释匀浆液。3.根据权利要求2所述的用于虾肝肠胞虫分离纯化、染色及计数的方法，其特征在于，所述粗提包括以下步骤：S2：将稀释匀浆液在4℃，600r/min离心10min，吸取上清液备用；向沉淀物中再加入无菌生理盐水至15～20ml，重悬；S3：将步骤S2所得的重悬液体在4℃，600r/min离心10min，吸取上清液，并与步骤S2所得上清液混合得混合上清液；S4：向步骤S3所得混合上清液中加入丙三醇，丙三醇与上清液按体积比1:3进行混合，在4℃，8000r/min离心30min，弃上清；沉淀物用20～25ml无菌生理盐水以4℃，6000r/min离心10min的条件离心清洗三次；S5：将步骤S4所得沉淀物用3～5ml无菌生理盐水重悬，得肝肠胞虫粗提液。4.根据权利要求3所述的用于虾肝肠胞虫分离纯化、染色及计数的方法，其特征在于，所述提纯包括以下步骤：S6：按照蔗糖溶液浓度由小到大的顺序，使用加长针头依次注入离心管最底部，每种浓度蔗糖溶液的注入量为1.5～2ml；S7：使用移液器缓慢加入1.5ml肝肠胞虫粗提液于蔗糖梯度液面最顶部，保证样品与最上层蔗糖溶液不混溶，接液面清晰可见；S8：将步骤S7配制好的蔗糖密度梯度离心液使用水平转子在4℃，2000r/min离心30min；S9:采用注射器从上至下吸取梯度分界处白色条带于离心管中，在4℃，6000r/min离心10min，弃上清，所得沉淀物用5～10ml无菌生理盐水以4℃，6000r/min离心10min的条件离心清洗三次，得到纯化的肝肠胞虫悬浮液。5.根据权利要求4所述的用于虾肝肠胞虫分离纯化、染色及计数的方法，其特征在于，所述步骤S6中注入蔗糖溶液的速度为1ml/min，所述步骤S6的总用时≤15min。6.根据权利要求5所述的用于虾肝肠胞虫分离纯化、染色及计数的方法，其特征在于，所述步骤S6中使用了五种浓度的蔗糖溶液，其浓度分别为20％、25％、30％、35％、40％；各浓度蔗糖溶液的配制方法分...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏俊利，孙妍，董学旺，陈浩楠，刘群，张丽，王健春，
申请(专利权)人：天津市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：