一种UPLC-MS/MS法检测血浆中利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物的方法技术

本发明专利技术公开了一种UPLC

【技术实现步骤摘要】
一种UPLC
‑
MS/MS法检测血浆中利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物的方法


[0001]本专利技术涉及一种利用超高效液相质谱联用技术进行的检测血浆中利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物（利福平、利福布汀、利福喷汀、利福平活性代谢物25
‑
去乙酰利福平、利福布汀活性代谢物25－O
‑
去乙酰利福布汀和利福喷汀活性代谢物25
‑
去乙酰利福喷汀）的方法，可用于这6种药物的治疗药物浓度监测，属于药物动力学分析


技术介绍

[0002]利福平（rifampin RFP）、利福布汀（rifabutin RFB）、利福喷汀（Rifapentine RFPT）同属于利福霉素类杀菌剂，通过抑制结核分枝杆菌的RNA聚合酶使菌体无法完成转录过程而死亡。近年来，结核病不规范治疗造成的耐药结病例数逐年递增，给结核病控制工作带来巨大挑战。研究显示，治疗两个月末痰菌未阴转的肺结核患者中，利福平的耐药率高达45%且单独使用时可迅速产生耐药。利福平耐药被认为是耐多药的重要标志。利福霉素衍生物—利福布汀、利福喷汀诞生了，以其低耐药率、高效价、不良反应发生率低等优点受到广泛关注。
[0003]利福布汀被批准用于预防和治疗HIV 感染者鸟分枝杆菌
‑
胞内分枝杆菌复合体的广泛播散性感染，也用于多重耐药结核病的治疗。药代动力学方面，利福布汀具有极强的膜穿透力，较利福平强3
‑
5倍，这使得利福布汀在临床应用的过程中能够迅速地渗透病灶，从而发挥其优良胞内杀菌活性。此外，利福布汀在体内能够广泛分布于各器官及组织细胞中。利福布汀在组织细胞中的浓度远高于血浆中的含量，其在胆道浓度可达血药浓度的300
‑
500倍。利福布汀在体内消除较为缓慢，血浆半衰期约为利福平的13倍，具有更高、更持久的效价及药理活性。对于肝功能轻度损害及肾功能不全的患者，利福布汀的药代动力学过程几乎不受影响；对于肝功能严重损害的患者，AUC明显增大。利福喷汀的蛋白结合率高达98%以上，在组织中停留时间较长, 消除半衰期为较利福平的4
‑
5倍，是一种长效抗结核药物，给药次数较少。
[0004]利福霉素类药物经由细胞色素P450代谢转化为具有药理活性的代谢物25
‑
去乙酰利福平、25
‑
去乙酰利福喷汀、25
‑
O
‑
去乙酰利福布汀。抗结核药物因其治疗窗窄，需要检测其血药浓度，从而抗结核药物的临床合理用药提供关键依据。然而目前临床上对利福霉素类药物的检测仍集中于主药的检测，基于代谢物具有药理活性，因此对利福霉素类药物活性代谢产物的检测也亟待开发。目前已有的利福霉素类及其代谢产物的联合检测方法仅在2015年有相关报道，但该方法存在诸多问题：如前处理时间过长（80分钟）难以满足临床样品快速检测的需求；而且该方法没有真正实现利福霉素类药物及其活性代谢物的同时检测，利福布汀及其代谢物是需要单独进样。因此急需开发前处理简单且分析时间短的检测方法，以满足临床检测的需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，建立一种前处理简单、快速、灵敏、准确度和精密度高的超高效液相色谱质谱联用（UPLC
‑
MS/MS）检测血浆中利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物（利福平、利福布汀、利福喷汀、利福平活性代谢物25
‑
去乙酰利福平、利福布汀活性代谢物25－O
‑
去乙酰利福布汀和利福喷汀活性代谢物25
‑
去乙酰利福喷汀）的方法，满足临床应用利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物浓度检测的需要和目的。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种LC
‑
MS/MS法同时检测血浆中利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物的方法，所述利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物为利福平、利福布汀、利福喷汀、利福平活性代谢物（25
‑
去乙酰利福平）、利福布汀活性代谢物（25－O
‑
去乙酰利福布汀）和利福喷汀活性代谢物（25
‑
去乙酰利福喷汀），所述方法包括如下步骤：S1.标准工作液配制分别精密称取3种利福霉素抗结核药物标准品、3种利福霉素抗结核药物活性代谢物及同位素内标粉末，分别用甲醇溶解并稀释成标准工作液；所述同位素内标包括：利福平
‑
d4、利福布汀
‑
d7、利福喷汀
‑
d8、25
‑
去乙酰利福喷汀
‑
d8；S2.标准曲线建立精密量取空白血浆，加入混合利福霉素类药物及其活性代谢产物标准工作液，以及混合同位素内标标准工作液，采用蛋白沉淀方法前处理，后利用UPLC
‑
MS/MS进行分析，得到各样本色谱图，以待测物峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，以待测物浓度为横坐标建立标准曲线；S3.待测样本检测S31.待测样本血浆前处理：精密量取待测血浆，加入混合同位素内标标准工作液，进行蛋白沉淀方法前处理；S32.利用UPLC
‑
MS/MS进行分析，得到各样品的色谱图，利用标准曲线计算出样本血浆中药物浓度；步骤S2或S32中，所述UPLC
‑
MS/MS的色谱流动相设定如下：A（水相）：0.1% 甲酸水溶液，B（有机相）：0.1% 甲酸乙腈；。
[0007]实验发现只有在该色谱流动相设定条件下，才能达到较好的检测效果。
[0008]通常，步骤S2或S31所述蛋白沉淀方法前处理的所用试剂为乙腈。
[0009]优选的，步骤S2中所述蛋白沉淀方法前处理的方法为：样本加入混合同位素内标
标准工作液，再加入5倍体积的乙腈，涡旋震荡0.8~1.5min后，低温离心，取出全部上清，即为供试品溶液，用UPLC
‑
MS/MS进样分析。
[0010]其中，所述涡旋震荡的时间为0.8~1.5（优选为1 min）。
[0011]优选地，所述离心为12000 r/min，离心温度为4℃，离心5min。
[0012]具体的，步骤S2中所述混合同位素内标标准工作液的体积为血浆和混合抗结核药物标准工作液总和的1/10。
[0013]优选的，步骤S2或S32中所述UPLC
‑
MS/MS的色谱条件为：流速0.3 mL/min；进样量10 μL；柱温40℃；进样室温度4℃。
[0014]优选的，步骤S2或S32所述UPLC
‑
MS/MS的色谱柱为Inertsil HILIC ( 2.1 mm
ꢀ×
150 mm, 3 μm)。
[0015]步骤S1中利福霉素类药物及其活性代谢产物的标准工作液的配制方法具体为：各精密称取五种利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物，用甲醇溶解为高浓度标准储备液，再用甲醇梯度稀释，配制成一系本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种UPLC
‑
MS/MS法同时检测血浆中利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物的方法，其特征在于：所述利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物为利福平、利福布汀、利福喷汀、25
‑
去乙酰利福平、25－O
‑
去乙酰利福布汀和25
‑
去乙酰利福喷汀，所述方法包括如下步骤：S1.标准工作液配制分别精密称取3种利福霉素抗结核药物标准品、3种利福霉素抗结核药物活性代谢物及四种同位素内标粉末，分别用甲醇溶解并稀释成标准工作液；所述同位素内标包括：利福平
‑
d4、利福布汀
‑
d7、利福喷汀
‑
d8、25
‑
去乙酰利福喷汀
‑
d8；S2.标准曲线建立精密量取空白血浆，加入混合利福霉素类药物及其活性代谢产物标准工作液，以及混合同位素内标标准工作液，采用蛋白沉淀方法前处理，后利用UPLC
‑
MS/MS进行分析，得到各样本色谱图，以待测物峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，以待测物浓度为横坐标建立标准曲线；S3.待测样本检测S31.待测样本血浆前处理：精密量取待测血浆，加入混合同位素内标标准工作液，进行蛋白沉淀方法前处理；S32.利用UPLC
‑
MS/MS进行分析，得到各样品的色谱图，利用标准曲线计算出样本血浆中药物浓度；步骤S2或S32中，所述UPLC
‑
MS/MS的色谱流动相设定如下：A水相：0.1%甲酸水溶液，B有机相：0.1%甲酸乙腈；。2.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴灵洁，刘小龙，叶珍洁，张晓颖，俞晓玲，
申请(专利权)人：福建医科大学孟超肝胆医院福州市传染病医院，
类型：发明
国别省市：