一种可搭乘红细胞的肿瘤新生抗原DNA纳米疫苗及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于纳米医学技术领域，具体涉及一种可搭乘红细胞的肿瘤新生抗原DNA纳米疫苗及其制备方法与应用，所述DNA纳米疫苗的成分包括PLGA、表达新生抗原的DNA质粒以及阳离子聚合物。所述DNA纳米疫苗为尺寸在20

【技术实现步骤摘要】
一种可搭乘红细胞的肿瘤新生抗原DNA纳米疫苗及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于纳米医学
，涉及一种可搭乘红细胞的肿瘤新生抗原DNA纳米疫苗的制备方法及其在肿瘤免疫治疗中的应用。

技术介绍

[0002]肝癌(hepatocellular carcinoma)是世界上常见的癌症之一。传统的肝癌治疗包括手术、放化疗和靶向治疗，但传统治疗手段均存在着临床预后普遍较差、术后生存率低等难题。而癌症免疫治疗通过利用和增强患者自身的免疫系统来消除原发性和转移性肿瘤细胞，已成为最有前途的癌症治疗方法之一，目前免疫检查点抑制剂以及CAR
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T细胞治疗被批准应用于临床。随着分子生物学、肿瘤免疫学以及肿瘤基因组学等技术的发展，肿瘤新生抗原 (neoantigen)逐渐被大家认知，由于肿瘤细胞的遗传不稳定常导致大量突变，非同义突变的表达可产生肿瘤特异性抗原，而这类新抗原只特异存在于肿瘤细胞中。2013年Rosenberg 团队通过外显子技术在肿瘤细胞系发现新生抗原并验证了其能激起机体免疫反应。至今，基于新生抗原的个体化肿瘤疫苗为近几年来衍生并发展起来的新的研究领域。
[0003]目前在研的新生抗原疫苗主要包括DNA疫苗、mRNA疫苗、多肽疫苗与细胞疫苗。其中DNA疫苗(DNA vaccine)主要是通过将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达产生的抗原激活机体免疫，与mRNA疫苗相比 DNA疫苗更加稳定。但是如何让DNA疫苗在体内维持有效的免疫应答仍然是一大挑战，传统的质粒DNA通过肌肉注射或皮下注射后DNA疫苗从注射部位快速扩散，也因此存在循环时间短以及易被清除等问题。因此，与传统的肌肉内和皮下注射DNA疫苗相比，将 DNA疫苗直接转染宿主树突状细胞是提高DNA疫苗效果的更有利策略。
[0004]DNA疫苗必须进入细胞核并进行转录、翻译后才能诱导相应的免疫反应，但多种细胞屏障限制了外源DNA的细胞核递送，所以基因递送载体是基因治疗的关键。目前，广泛使用的基因递送载体可分为病毒与非病毒基因递送系统。病毒基因递送系统的转染以及表达效率高，但存在潜在的野生型感染以及致癌性等毒副作用，且受病毒自身体积的限制装载目的基因的容量十分有限。常见的非病毒载体有阳离子脂质体和阳离子高聚物，其中脂质体DNA 复合物是非病毒载体中应用最广泛的载体，具有制备简单、高生物安全性以及装载基因的容量可调性等优势，因此非病毒载体在疫苗递送中提现较为明显的优势，可用来制备新生抗原 DNA纳米疫苗；现有技术中通过制备可生物降解的PLGA纳米粒子(NPs)，能够将基因包裹于纳米粒子内部，进而互相结合形成纳米粒子
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基因复合物，可以有效的保护基因在体内不被破坏，并通过纳米粒子良好的细胞结合和摄取能力，将基因导入细胞中进行表达，从而达到治疗作用，然而，PLGA包载基因存在包载效率低和释放速度慢的问题。由于阳离子聚合物(polycation)带有正电荷，能与带有负电荷的DNA相互作用，形成复合物(polyplex)并用于基因转染，聚乙烯亚胺(PEI)是目前研究最广泛的阳离子基因载体，分子量大的PEI具有较高的基因转染效率，但也具有较高的细胞毒性，而分子量小的PEI虽然没
有细胞毒性，但几乎不能介导基因转染。因此，通过修饰分子量大的PEI降低细胞毒性是一种有效策略，现有技术通过将带正电的修饰的PEI络合基因形成复合物，可以在体外有效提高转染效率，但是存在体内释放基因不可控以及易被清除等问题，导致基因无法导入细胞中并表达。
[0005]为解决NPs体内清除快及红细胞载体释药不可控的问题，现有技术中通常采用脂质体挤压法，将红细胞膜先超声，之后使用脂质体挤压器先后过400nm以及200nm膜，将制备后的红细胞膜与PLGA纳米粒均匀混合，再过200nm的膜，得到RBC
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NP，RBC
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NP同时呈壳
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核结构，核心为PLGA，外包裹单层红细胞膜，但RBC
‑
NP不具有靶向性，在体内存在非特异性分布的问题。
[0006]而将DNA纳米疫苗直接靶向到免疫器官如脾脏等可以有利提高基因的递送并发挥疫苗的作用激活机体免疫。
[0007]综上所述，有必要构建一种搭乘于红细胞的DNA纳米疫苗，实现DNA纳米疫苗靶向输送，并诱导机体产生免疫反应的同时减少副作用的发生，这在肿瘤免疫治疗领域具有重要意义。
[0008]目前，肿瘤分子生物学的迅速发展创新了肿瘤治疗的新模式，肿瘤靶向生物治疗逐渐成为肿瘤治疗的新趋势，并取得一些突破性进展。肿瘤靶向生物治疗是利用抗原
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抗体、配体
‑ꢀ
受体之间的特异性结合作用，将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位，或抗体本身作为治疗药物，使治疗作用或药物效应尽量局限在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而提高疗效、减少毒副作用的一种方法。但这种方法需要筛选肿瘤细胞特异表达的某类分子或高表达与肿瘤增殖、侵袭相关的受体，找到这些受体的难度很高，影响了这类方案的实施。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供了一种可搭乘红细胞的肿瘤新生抗原DNA 纳米疫苗及其制备方法和应用，所述DNA纳米疫苗包含DNA疫苗以及阳离子聚合物，阳离子聚合物可提高转染效率，将DNA纳米疫苗递送给抗原提呈细胞，通过红细胞实现靶向输送至脾脏，激活脾脏免疫，诱导机体产生系统性抗肿瘤免疫反应，是一种安全高效具有临床转化价值的新型肿瘤疫苗。
[0010]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]一种可搭乘红细胞的肿瘤新生抗原DNA纳米疫苗，所述DNA纳米疫苗粒径在20
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200 nm，其为具有球形结构的纳米体系，所述纳米体系的内核为阳离子聚合物PC与DNA疫苗形成的复合物，丙交酯
‑
乙交酯共聚物PLGA裹于内核表面，所述DNA疫苗为将表达肿瘤细胞抗原的核苷酸序列插入到空载质粒上后得到的质粒pDNA，所述DNA纳米疫苗可通过静电吸附搭乘在红细胞表面。
[0012]本专利技术优选的方案中，所述阳离子聚合物PC由聚乙烯亚胺(PEI
25000
)和1,2
‑
环氧十四烷反应得到，所述丙交酯
‑
乙交酯共聚物PLGA为PLGA 50：50，更优选的，所述阳离子聚合物由聚乙烯亚胺(PEI
25000
)和1,2
‑
环氧十四烷以质量比1：(0.5
‑
10)在90℃下反应48h 得到用1,2
‑
环氧十四烷修饰的阳离子聚合物PC，反应介质为无水乙醇。
[0013]优选地，所述PEI
25000
和1,2
‑
环氧十四烷的质量比为1：(0.5
‑
5)，最优选为1：0.5。
[0014]上述P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可搭乘红细胞的肿瘤新生抗原DNA纳米疫苗，所述DNA纳米疫苗粒径在20
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200nm，其为具有球形结构的纳米体系，所述纳米体系的内核为阳离子聚合物PC与DNA疫苗形成的复合物，丙交酯
‑
乙交酯共聚物PLGA裹于内核表面，所述DNA疫苗为将表达肿瘤细胞抗原的核苷酸序列插入到空载质粒上后得到的质粒pDNA，所述DNA纳米疫苗可通过静电吸附搭乘在红细胞表面。2.根据权利要求1所述的DNA纳米疫苗，其特征在于，所述阳离子聚合物PC由聚乙烯亚胺(PEI
25000
)和1,2
‑
环氧十四烷反应得到，所述丙交酯
‑
乙交酯共聚物PLGA为PLGA 50：50。3.根据权利要求2所述的肿瘤新生抗原DNA纳米疫苗，其特征在于，所述肿瘤细胞包括Hepa 1
‑
6(小鼠肝癌细胞)、B16
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F10(小鼠皮肤黑色素瘤细胞)、CT26(小鼠结肠癌细胞)、MC38(小鼠结肠癌细胞)、RH35(大鼠肝癌细胞)、4T1(小鼠乳腺癌细胞)、GL261(小鼠脑胶质瘤)或U87(人脑星形胶质母细胞瘤)中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的肿瘤新生抗原DNA纳米疫苗，其特征在于，所述表达肿瘤细胞抗原的核苷酸序列如SEQ ID.NO.1所示，所述肿瘤细胞为Hepa 1
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6细胞，所述质粒pDNA的核苷酸序列如SEQ ID.NO.2所示。5.如权利要求4所述的肿瘤新生抗原DNA纳米疫苗，其特征在于，所述质粒pDNA表达肿瘤细胞抗原，肿瘤细胞抗原的氨基酸序列如SEQ ID.NO.3所示。6.如权利要求4所述的肿瘤新生抗原DNA纳米疫苗，其特征在于，所述肿瘤细胞抗原包含7个免疫原性抗原肽，各抗原肽之间通过10个氨基酸长度的连接肽连接，7...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小龙，吴名，曾永毅，罗自金，蔡志雄，
申请(专利权)人：福建医科大学孟超肝胆医院福州市传染病医院，
类型：发明
国别省市：