一种弓形虫荧光PCR检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提出了一种弓形虫荧光PCR检测试剂盒及其使用方法，包括根据弓形虫重复区域AF146527序列设计的引物和探针，根据人锚定蛋白重复区域53设计的内标引物和内标探针，Taq DNA聚合酶，dNTPs，Tris

【技术实现步骤摘要】
一种弓形虫荧光PCR检测试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种弓形虫荧光PCR检测试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]弓形虫是人和动物共患的一种可寄生于细胞内的原虫，不同国家不同地区感染率有所不同，其感染率为0.6％
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45％；以欧洲国家感染率最高，我国各地孕妇感染率为4％
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10％。近年来，由于我国家庭宠物数目的增多，感染率有上升的趋势。弓形虫感染多为隐性感染，在组织中形成包囊，一旦机体抵抗力下降时，包囊破裂，裂殖体逸出并扩散时可表现为急性症状，妊娠早、中期感染可引起流产和胎儿多发性畸形，如脑积水、小眼、无眼症、先天性白内障、唇腭裂等，以及先天性心脏病、肛门闭锁和肢体畸形，晚期感染可导致早产、围生儿死亡、先天性急性弓形虫病。患弓形体病的孕妇，主要通过胎盘感染胎儿，或胎儿吞咽被污染的羊水而感染，母婴平均传播率为40％。
[0003]目前，我国临床上对弓形虫病原体的检测仍以酶联免疫诊断技术为主。该方法是检测母体血清中的特异性IgM、IgG抗体。IgM阳性作为初次感染的诊断指标，IgG阳性看作是既往感染。随着现代核酸技术的发展，建立在基因水平上的实时荧光定量PCR技术由于其高灵敏性和高特异性，在临床检测中得到广泛应用。
[0004]有鉴于此，本专利技术提出了一种检测弓形虫病原体的荧光定量PCR试剂盒及其应用。专利技术人经过长期大量的实验研究，摸索出合适的引物对和荧光探针序列、比例及工具酶和其浓度配比，使得可以快速准确检测病原体的核酸，具有高准确度和高灵敏度，操作方便快捷，大大降低检测成本。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提出了可以检测弓形虫病毒，并且具有较高的灵敏度和特异性的一种弓形虫荧光PCR检测试剂盒及其使用方法。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种弓形虫荧光PCR检测试剂盒，包括根据弓形虫重复区域AF146527序列设计的引物和探针，根据人锚定蛋白重复区域53设计的内标引物和内标探针；所述探针和内标探针的5'端均标记荧光基团，3'端均标记淬灭基团和PO4基团。
[0007]在以上技术方案的基础上，优选的，所述根据弓形虫重复区域AF146527序列设计的引物和探针包括：正向引物：5'
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ATGCGATCCAGACGAGACGA
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3'，如SEQ ID NO:1所示；反向引物：5'
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CTCCTCCCTTCGTCCAAGC
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3'，如SEQ ID NO:2所示；探针：5'
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CACTCTTCAATTCTCTCCGCCATCACCACG
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3'，如SEQ ID NO:3所示；所述探针3'端的第1位碱基被锁核酸修饰。
[0008]在以上技术方案的基础上，优选的，所述正向引物和反向引物的终浓度均为0.3
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0.5μmol/L，探针的终浓度为0.1
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0.3μmol/L。
[0009]在以上技术方案的基础上，优选的，所述根据人锚定蛋白重复区域53设计的内标引物和内标探针包括：正向引物：5'
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CGTGGACCTGCTGACCAA
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3'，如SEQ ID NO:4所示，反向引物：5'
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CCGTTGCATGTCTGAGCATT
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3'，如SEQ ID NO:5所示；内标探针：5'
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ATAGCCAGACACCCCTGCACCTCG
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3'，如SEQ ID NO:6所示；所述内标探针3'端的第1位碱基被锁核酸修饰。
[0010]在以上技术方案的基础上，优选的，所述内标引物的正向引物和反向引物的终浓度均为0.08
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0.10μmol/L，内标探针的终浓度为0.04
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0.06μmol/L。
[0011]在以上技术方案的基础上，优选的，所述还包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、Tris
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HCL、MgSO4、PEG6000和甘油。
[0012]在以上技术方案的基础上，优选的，所述Taq DNA聚合酶的终浓度为10
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15U，dNTPs的终浓度为0.1
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0.3mmol/L，Tris
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HCL的终浓度为55
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60mmol/L，MgSO4的终浓度为6
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10mmol/L，PEG 6000的质量分数为6
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8％，甘油的质量分数为5
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7％。
[0013]在以上技术方案的基础上，优选的，所述荧光基团为HEX、JOE、VIC和ROX中的一种或多种，所述猝灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的一种或多种。
[0014]本专利技术还提供了一种弓形虫荧光PCR检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0015]S1，提取样本DNA；
[0016]S2，配备PCR扩增反应体系进行PCR扩增，扩增步骤：50℃预变性2min；95℃变性3min；95℃退火10s，60℃延伸1min，40个循环；
[0017]S3，根据通道扩增模板的荧光信号强弱和循环阈值判断结果。
[0018]本专利技术还提供了一种弓形虫荧光PCR检测试剂盒在临床检测上的应用。
[0019]本专利技术的一种弓形虫荧光PCR检测试剂盒及其使用方法相对于现有技术具有以下有益效果：
[0020](1)本专利技术采用锁核酸修饰探针，可以在PCR过程中对目的片段进行富集，检测灵敏度和特异性得到进一步提高。
[0021](2)本专利技术PCR缓冲液中的PEG6000和甘油可改善DNA变性复性情况、去除非特异扩增，提高反应效率和特异性。
[0022](3)本专利技术内参照系统基于人管家基因锚定蛋白重复区域53设计，能在人体样本提取核酸中稳定扩增，可以实时反映样本质量和核酸提取效果，避免因样本保存条件问题或核酸提取质量较差导致的假阴性。
[0023](4)使用本专利技术试剂盒可以在PCR反应管里上机检测病原体核酸，检测限为1000copies/mL，检测通量高，操作方便快捷，准确度和灵敏度高，不会出现假阳性和假阴性结果，大大降低了筛查成本。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1为本专利技术的弓形虫通道的荧光扩增曲线图；
[0026]图2为本专利技术的内标通道的荧光扩增曲线图；
[0027]图3为本专利技术试剂盒的特异性检测图。
具体实施方式
[0028]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种弓形虫荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括根据弓形虫重复区域AF146527序列设计的引物和探针，根据人锚定蛋白重复区域53设计的内标引物和内标探针；所述探针和内标探针的5'端均标记荧光基团，3'端均标记猝灭基团和PO4基团。2.如权利要求1所述的一种弓形虫荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述根据弓形虫重复区域AF146527序列设计的引物和探针包括：正向引物：5'
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ATGCGATCCAGACGAGACGA
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3'，如SEQ ID NO:1所示；反向引物：5'
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CTCCTCCCTTCGTCCAAGC
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3'，如SEQ ID NO:2所示；探针：5'
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CACTCTTCAATTCTCTCCGCCATCACCACG
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3'，如SEQ ID NO:3所示；所述探针3'端的第1位碱基被锁核酸修饰。3.如权利要求2所述的一种弓形虫荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述正向引物和反向引物的终浓度均为0.3
‑
0.5μmol/L，探针的终浓度为0.1
‑
0.3μmol/L。4.如权利要求1所述的一种弓形虫荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述根据人锚定蛋白重复区域53设计的内标引物和内标探针包括：正向引物：5'
‑
CGTGGACCTGCTGACCAA
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3'，如SEQ ID NO:4所示，反向引物：5'
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CCGTTGCATGTCTGAGCATT
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3'，如SEQ ID NO:5所示；内标探针：5'
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ATAGCCAGACACCCCTGCACCTCG
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3'，如...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊慧，高峰英，肖樊，
申请(专利权)人：武汉思泰得医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：