一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提出了一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒及其使用方法，试剂盒包括根据VZV gB基因序列设计的引物和探针，基于人管家基因锚定蛋白重复区域53设计的内标引物和探针，上述探针均为锁核酸修饰的探针，3'端标记PO4基团。本发明专利技术的试剂盒能够准确检测出血清或血浆样品中是否含有VZV病毒，检测限可达到25copies/μL，具有较高的灵敏度和特异性。具有较高的灵敏度和特异性。具有较高的灵敏度和特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]水痘
‑
带状疱疹病毒(VZV)属于疱疹病毒α亚科，人类疱疹病毒3型，为双链DNA病毒，基因组由125000bp的碱基组成，是较小的疱疹病毒之一，其编码的蛋白质至少有71种。VZV为圆形颗粒，直径为150～200nm，中央为双链DNA核心，表面由162个壳微粒组成的对称20面体。人是VZV的唯一自然宿主，并且普遍对其易感。初次感染表现为水痘，病毒能够在宿主的脊髓感觉神经节潜伏，结果再次激活后表现为带状疱疹。VZV感染还可引起多种并发症，这些并发症症状较重，甚至可引起严重的后遗症。此外妊娠期感染VZV还可能引起胎儿畸形、早产或死胎。VZV的早期诊断对于VZV相关并发症的预防，儿童的身体健康和我国的人口健康有着重要意义。
[0003]目前VZV诊断以血清学手段为主，由于方法学的限制存在灵敏度和准确性不足的问题，需要一种高灵敏度和特异性的检测手段。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术提出了可用于检测血清或血浆中的VZV病毒核酸，具有较高的灵敏度和特异性的一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒及其使用方法。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒，包括根据VZV gB基因序列设计的引物和探针，所述引物包括SEQ ID NO:1所示的正向引物；SEQ ID NO:2所示的反向引物；所述探针为SEQ ID NO:3所示探针；所述探针的3'端第1个碱基被锁核酸修饰，并标记PO4基团。
[0006]在以上技术方案的基础上，优选的，所示探针的5'端标记FAM荧光基团，3'端标记BHQ2猝灭基团。
[0007]在以上技术方案的基础上，优选的，引入了一个人工构建的内标系统用于避免检测结果假阴性，所述内标系统包括内标引物和内标探针。
[0008]在以上技术方案的基础上，优选的，所述内标系统基于人管家基因锚定蛋白重复区域53设计，所述内标系统的引物和探针包括由SEQ ID NO:4所示的内标正向引物，由SEQ ID NO:5所示的内标反向引物和由SEQ ID NO:6所示的内标探针。
[0009]在以上技术方案的基础上，优选的，所述内标探针5'端标记VIC荧光基团，3'端标记BHQ1猝灭基团和PO4基团。
[0010]在以上技术方案的基础上，优选的，所示内标探针的3'端第1个碱基被锁核酸修饰，并标记PO4基团。
[0011]在以上技术方案的基础上，优选的，PCR反应体系包括2
×
QX200 Bio
‑
rad ddPCR Supermix for Probes 10μL、1.2μL 10μmol/L如SEQ ID NO:1
‑
2所示的引物、0.6μL 10μ
mol/L如SEQ ID NO:3所示的探针、0.8μL 10μmol/L如SEQ ID NO:4
‑
5所示的引物、0.4μL 10μmol/L如SEQ ID NO:6所示的探针。
[0012]本专利技术还提供了一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0013]S1，提取样本DNA；
[0014]S2，配置数字PCR反应液；
[0015]S3，制备微滴，PCR扩增，扩增步骤：95℃变性10min；94℃退火15s；58℃延伸60s，退火
‑
延伸共40个循环；98℃ 10min，4℃ 5min，结束反应。
[0016]S4，使用微滴读取仪进行微滴读取和分析。
[0017]在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S1所述样本为血清或血浆。
[0018]本专利技术的一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒及其使用方法相对于现有技术具有以下有益效果：
[0019](1)本专利技术探针为锁核酸探针，在数字PCR过程中能够对目的片段进行富集，进一步提高了检测灵敏度和特异性。
[0020](2)本专利技术内标系统基于人管家基因锚定蛋白重复区域53设计，能在人体样本提取核酸中稳定扩增，可以实时反映样本质量和核酸提取效果，避免因样本保存条件问题或核酸提取质量较差导致的假阴性。
[0021](3)本专利技术的试剂盒能够准确检测出血清或血浆样品中是否含有VZV病毒，检测限可达到25copies/μL，具有较高的灵敏度和特异性。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1为基于双荧光探针的VZV病毒定量检测结果VZV gB基因和内标基因阳性、阴性结果二维图(样本浓度2500copies/μL)；
[0024]图2为基于双荧光探针的VZV病毒定量检测结果VZV gB基因和内标基因阳性、阴性结果二维图(样本浓度25copies/μL)。
具体实施方式
[0025]下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。
[0026]VZV病毒数字PCR检测试剂盒包括根据VZV gB基因序列设计的引物和探针和根据人锚定蛋白重复区域53设计引物和探针，具体引物和探针序列如下：
[0027]根据VZV gB基因序列设计引物和探针如下：
[0028]正向引物：5'
‑
ACACCCGACTCGAAATACCAG
‑
3'，如SEQ ID NO:1所示；
[0029]反向引物：5'
‑
GAGCATAGCAAATTCCACCGAT
‑
3'，如SEQ ID NO:2所示；
[0030]探针：5'
‑
TCCCGACGAAGCGTGCCAGTTGAGT
‑
3'，如SEQ ID NO:3所示；
[0031]PCR扩增产物：ACACCCGACTCGAAATACCAGATCCCGACGAAGCGTGCCAGTTGAGTTGCGTGCCAATAGAACAATAACAACCACCTCATCGGTGGAATTTGCTATGCTC，如SEQ ID NO:7所示；
[0032]根据人锚定蛋白重复区域53设计引物和探针如下：
[0033]正向引物：5'
‑
CGGCCCACAATGTGGAATG
‑
3'，如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒，其特征在于：包括根据VZV gB基因序列设计的引物和探针，所述引物包括SEQ ID NO:1所示的正向引物；SEQ ID NO:2所示的反向引物；所述探针为SEQ ID NO:3所示探针；所述探针的3'端第1个碱基被锁核酸修饰，并标记PO4基团。2.如权利要求1所述的一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所示探针的5'端标记FAM荧光基团，3'端标记BHQ2猝灭基团。3.如权利要求1所述的一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒，其特征在于：引入了一个人工构建的内标系统用于避免检测结果假阴性，所述内标系统包括内标引物和内标探针。4.如权利要求4所述的一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述内标系统基于人管家基因锚定蛋白重复区域53设计，所述内标系统的引物和探针包括由SEQ ID NO:4所示的内标正向引物，由SEQ ID NO:5所示的内标反向引物和由SEQ ID NO:6所示的内标探针。5.如权利要求4所述的一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述内标探针5'端标记VIC荧光基团，3'端标记BHQ1猝灭基团和PO4基团。6.如权利要求4所述的一种VZV病毒数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所示内标探针的3'端第1个碱基被锁核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊慧，高峰英，肖樊，尹璐，林涵，
申请(专利权)人：武汉思泰得医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：