一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法及其应用，该新冠病毒基因单碱基突变检测方法基于聚乙二醇辅助，通过发夹探针PS

【技术实现步骤摘要】
一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于基因检测领域，具体涉及一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS
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CoV
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2)是一种危害性极强的RNA病毒，其变异能力强。全球多个国家和地区普遍监测到SARS
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CoV
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2的S蛋白容易发生氨基酸突变，特别是受体结合区或单克隆抗体结合位点氨基酸突变引起病毒的传播力和致病力改变以及部分免疫逃逸等。以新冠病毒德尔塔变异株为例，其传染性和传播能力有明显增强，自首次发现以来，蔓延迅速。因此，为了降低传播风险，为病毒的变异做好预警，实现SARS
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CoV
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2基因的实时突变检测，对疫情防控，流行病学调查等具有重要意义。
[0003]目前，SARS
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CoV
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2基因突变检测主要依赖于基因测序技术。该技术对SARS
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CoV
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2全长基因组进行分析，获取全基因组的基因突变信息，并用于疾病治疗、流行病学分析等。目前的测序技术虽然具有高度的准确性和敏感性，能够全面反映病原体的遗传信息，但往往需要依托精密且价值昂贵的仪器，检测耗时长，测序结果依赖于专业人员分析解读，检测样品量相对较少，较难运用于大规模临床检测和现场快检，无法实现大范围推广、快速诊断的目的，对于监控流行性病毒(如SARS
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CoV
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2)的新型变异和突变存在滞后性。
[0004]实时荧光定量PCR技术是目前WHO最推荐的SARS
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2检测方法之一，也是目前SARS
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2检测的金标准。但实时荧光定量PCR并不能直接检测SARS
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2突变位点，而仅仅只能够用于SARS
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2的定性诊断或定量检测，在此基础上结合基因测序技术检测受试者的SARS
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2突变位点。环介导等温扩增技术也是常用于检测SARS
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2的技术之一，其也存在着无法直接确定基因突变位点，需要辅以测序技术的问题。
[0005]因此，为了能够更加有效的监控病毒发展趋势，了解病毒变异情况，开发一种操作简便、检测灵敏的可用于检测基因中单碱基突变的检测方法对于流行病学监控以及人群健康监控具有极为重要的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法及其应用，本专利技术中的新冠病毒基因单碱基突变检测方法能够快速高效的检测出SARS
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2基因单碱基突变，检测灵敏，特异性好，对于新冠病毒的变异株的筛查和监控具有极为重要的推动作用。
[0007]本专利技术的第一个方面，提供一种新冠病毒单碱基突变检测发夹探针，该发夹探针包括PS
‑
HP1和HP2。
[0008]根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述PS
‑
HP1依次含有发夹互补序列、新冠病毒靶向序列和新冠病毒单碱基突变识别位点。所述HP2依次含有发夹互
补序列和新冠病毒靶向序列。
[0009]其中，所述发夹互补序列中含有发夹互补序列，以形成茎环结构；所述新冠病毒单碱基突变识别位点用于区分野生型新冠病毒和单碱基突变型新冠病毒。
[0010]在本专利技术的一些实施方式中，所述PS
‑
HP1的核苷酸序列为：PS
‑
HP1：HP1：
[0011]其中，对PS
‑
HP1的5
’
端第1～20位碱基(TAGAATTCTAATGAATTCTA)进行硫代磷酸化修饰。
[0012]在本专利技术实施例中，PS
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HP1的硫代磷酸化修饰服务由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。
[0013]所述HP2的核苷酸序列为：HP2：所述HP2的核苷酸序列为：HP2：其5
’
端为磷酸化(PO4)修饰。
[0014]其中，PS
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HP1和HP2中仅加粗的部分为靶向SARS
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2基因的新冠病毒靶向序列。
[0015]PS
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HP1和HP2中的标有下划线的部分为发夹互补序列，以形成茎环结构。
[0016]PS
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HP1的3
’
端的最后一个碱基C则是新冠病毒单碱基突变识别位点。
[0017]根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述新冠病毒单碱基突变株包括SARS
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CoV
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2D614G。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述SARS
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CoV
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2D614G优选为含有如SEQ ID NO.3所示特征序列的SARS
‑
CoV
‑
2D614G。
[0019]本专利技术的第二个方面，提供一种新冠病毒单碱基突变检测试剂，该检测试剂中含有本专利技术第一个方面所述的发夹探针。
[0020]根据本专利技术的第二个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述新冠病毒单碱基突变株包括SARS
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CoV
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2D614G。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述SARS
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CoV
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2D614G优选为含有如SEQ ID NO.3所示特征序列的SARS
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CoV
‑
2D614G。
[0022]本专利技术的第三个方面，提供一种新冠病毒单碱基突变检测试剂盒，所述检测试剂盒中含有本专利技术第二个方面所述的检测试剂、聚乙二醇和高保真DNA连接酶。
[0023]根据本专利技术的第三个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述检测试剂盒中还含有高保真DNA连接酶缓冲液、信号扩增体系缓冲液。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述信号扩增体系缓冲液中优选包括DNA聚合酶和双链DNA染料。
[0025]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述信号扩增体系缓冲液为：
[0026]组分含量7～8U/μL DNA聚合酶0.45～0.5μL；25～30mM dNTPs0.45～0.5μL；10
×
SYBR Green I2～2.5μL；500～550μM甜菜碱0.8～1μL；10
×
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新冠病毒单碱基突变检测发夹探针，其特征在于，所述发夹探针包括PS
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HP1和HP2；所述PS
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HP1依次含有发夹互补序列、新冠病毒靶向序列和新冠病毒单碱基突变识别位点；所述PS
‑
HP1的5
’
端发夹互补序列经硫代磷酸化修饰；所述HP2依次含有发夹互补序列和新冠病毒靶向序列；所述发夹互补序列中含有发夹互补序列，以形成茎环结构；所述新冠病毒单碱基突变识别位点用于区分野生型新冠病毒和单碱基突变型新冠病毒。2.根据权利要求1中所述的发夹探针，其特征在于，所述PS
‑
HP1的核苷酸序列为：5
’‑
TAGAATTCTAATGAATTCTATTCTGTGCAGTTAACAC
‑3’
(SEQ ID NO.1)；所述HP2的核苷酸序列为：5
’‑
CCTGATAAAGAACAGCAACCTGGTTAGTGGAATACCACTAAC
‑3’
(SEQ ID NO.2)。3.一种新冠病毒单碱基突变检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中含有权利要求1～2任一项所述的发夹探针。4.一种新冠病毒单碱基突变检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中含有权利要求3所述的检测试剂、聚乙二醇和高保真DNA连接酶。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还含有信号扩增体系缓冲...

【专利技术属性】
技术研发人员：余路新，陈章权，汤子彬，邓玉玲，何素辉，孙元中，郑国柱，王厚淇，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：