靶核酸的检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了靶核酸的检测方法及其应用。本申请的第一方面，提供非疾病诊断目的的靶核酸的检测方法，包括以下步骤：提供基底，基底上固定有标记了荧光报告基团的RNA链；将Csm复合体、Csm6蛋白、核酸样本与基底接触反应，反应结束后冲洗基底；利用全内反射荧光显微镜对反应前后的基底分别采集荧光信号，根据荧光强度变化得到核酸样本中的靶核酸浓度。Csm复合体识别靶核酸生成cA4，进一步激活Csm6蛋白的非特异性剪切单链RNA的活性，从而将锚定在基底上的RNA链剪切使得荧光报告基因随剪切游离出去，降低了基底上的荧光报告基团的量。利用TIRFM的高信噪比获得明显的信号，提高检测的准确性和灵敏度。准确性和灵敏度。准确性和灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
靶核酸的检测方法及其应用


[0001]本申请涉及核酸检测
，尤其是涉及靶核酸的检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]通过快速、高效的检测及时发现轻症和无症状感染者体内的新型冠状病毒SARS
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CoV
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2及其变异株，能够给予早期诊断、治疗以及追踪密切接触者以便利，扩大准确且有效的诊断检测范围。因此，快速、准确、低成本且可扩展的新型冠状病毒SARS
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CoV
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2及其变异株(即RNA病毒)检测技术的开发和改良对日益增长的公共卫生需求而言尤为重要。早期新型冠状病毒SARS
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CoV
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2的RNA检测大多数依赖逆转录
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聚合酶链式反应(RT
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PCR)，但这种方法速度较慢，需要复杂、繁琐的仪器支撑。相比之下，环介导等温扩增技术(LAMP)已通过改进成为一种即时、灵敏的病毒检测方法，但基于LAMP技术的病毒检测方法容易出现假阳性。
[0003]为此，研究者将
Ⅴ
型和Ⅳ型CRISPR/Cas系统(分别以Cas12、Cas13蛋白为基础)与LAMP技术结合，经等温扩增后，以RNA为导向的Cas12或Cas13蛋白结合于目标序列，触发非特异性核酸酶的活性，使得用于标记RNA的荧光团或淬灭剂被剪切，导致荧光信号增强，得以检测。这种病毒检测技术中需要针对目的序列上游的核酸信号放大，虽然这种信号放大过程提高了检测的灵敏度，但通常需要前期的核酸扩增技术来保证反应的结果足够明显，而这就延长了检测时间，因此，有必要开发出一种能够同时具有较高的准确性和灵敏度的检测技术。

技术实现思路

[0004]本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种较高的准确性和灵敏度的靶核酸的检测方法及其应用。
[0005]本申请的第一方面，提供非疾病诊断目的的靶核酸的检测方法，包括以下步骤：
[0006]提供基底，基底上固定有标记了荧光报告基团的RNA链；
[0007]将Csm复合体、Csm6蛋白、核酸样本与基底接触反应，反应结束后冲洗基底；Csm复合体为丧失RNA剪切活性的突变体；
[0008]利用全内反射荧光显微镜对反应前后的基底分别采集荧光信号，根据荧光强度变化得到核酸样本中的靶核酸浓度。
[0009]根据本申请实施例的检测方法，至少具有如下有益效果：
[0010]当Csm复合体识别靶核酸与其结合后，会激活合成环状寡聚腺苷酸cA4的活性，生成的cA4进一步激活Csm6蛋白的非特异性剪切单链RNA的活性，从而将锚定在基底上的RNA链剪切，而RNA链上标记的荧光报告基因随剪切游离出去，降低了基底上的荧光报告基团的量。在此过程中，利用全内反射荧光显微镜(TIRFM)进行检测，TIRFM利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光报告基团，同时由于激发光呈指数衰减的特性，大大降低了背景光噪声，有效提高了检测的准确性。因此，利用TIRFM对反应前后的基底分别成像，即可根据前后荧光强度的衰减反映靶核酸的浓度，通过其高信噪比获得明显的信号，提
高检测的准确性和灵敏度。
[0011]需要说明的是，Ⅲ型CRISPR
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Cas系统是目前发现的所有CRISPR
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Cas系统中最复杂的一类，而Ⅲ型CRISPR
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Cas系统中的A亚型具有一个Csm效应复合体，该复合体由5种不同的Csm蛋白(Csm1～5)与crRNA共同组成，其中的Csm1也即Cas10蛋白。Csm复合体具有结合并切割与crRNA互补的靶核酸的活性，会导致靶核酸解离并使得Cas10蛋白失活，而本方案中通过不含RNA剪切活性的Csm突变复合体，使得Cas10蛋白的聚合酶活性得以保留，催化核苷酸聚合，产生环状核苷酸cA4等产物，利用cA4激活Csm6蛋白的非特异性剪切单链RNA的活性，实现信号扩大的目的，提高检测灵敏度。
[0012]在本申请的一些实施方式中，Csm复合体和Csm6蛋白来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)，以下将其分别记为TtCsm复合体和TtCsm6蛋白。
[0013]在本申请的一些实施方式中，Csm复合体的Csm3具有D34A突变。TtCsm复合体的Csm3引入D34A突变后，使得复合体在保留结合靶核酸活性的同时，丧失了Csm3介导的靶核酸切割活性。
[0014]在本申请的一些实施方式中，还包括将所述ATP、所述Csm复合体与所述核酸样本接触反应，检测产物浓度，换算得到所述靶核酸浓度的步骤，所述产物选自氢离子、焦磷酸盐中的至少一种。
[0015]在本申请的一些实施方式中，检测氢离子的方法为：在反应体系中加入pH敏感性染料，根据染料变色情况，得出氢离子浓度。pH敏感性染料可以是任选随pH变化改变发光波段的指示剂，包括但不限于酚红、溶剂绿等。
[0016]在本申请的一些实施方式中，检测焦磷酸盐的方法为：在反应体系中加入Mn
2+
和钙黄绿素，检测钙黄绿素的荧光强度，得出焦磷酸盐浓度。通常条件下，钙黄绿素的荧光被Mn
2+
淬灭，而在反应体系中生成的焦磷酸盐与钙黄绿素竞争结合Mn
2+
，与焦磷酸盐对钙黄绿素的竞争结合，使得钙黄绿素因为缺少Mn
2+
而发出荧光，根据钙黄绿素的荧光强度可以换算得到焦磷酸盐的浓度。
[0017]在本申请的一些实施方式中，在检测焦磷酸盐过程中，反应体系中还加入碱土金属离子，碱土金属离子会与钙黄绿素生成高荧光复合物，从而降低检测限。
[0018]在本申请的一些实施方式中，靶核酸的样本来源于动物、植物、人体、微生物、土壤、水源。
[0019]在本申请的一些实施方式中，靶核酸为病毒核酸，进一步为冠状病毒核酸，更进一步为SARS
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CoV
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2病毒的核酸。可以理解的是，为了方便检测，靶核酸选择病毒的特异性保守序列，例如，对于SARS
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CoV
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2病毒的核酸可选N蛋白(核衣壳蛋白)基因、orf1ab基因的相关序列。
[0020]在本申请的一些实施方式中，RNA链通过链霉亲和素
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生物素作用固定在所述基底上。
[0021]在本申请的一些实施方式中，基底为玻片。
[0022]在本申请的一些实施方式中，接触反应的时间为3～8min。
[0023]在本申请的一些实施方式中，在接触反应前还包括对靶核酸进行扩增的步骤。由于实际操作过程中可能存在一些检测方法反应不够明显的问题，因此可采取预先扩增的方法进一步放大检测信号。优选的，可以采用重组酶聚合酶扩增(RPA)技术，该方法所需时间
短，反应条件要求低。
[0024]本申请的第二方面，提供试剂盒，该试剂盒包括：
[0025]基底，基底用于固定标记荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.非疾病诊断目的的靶核酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提供基底，所述基底上固定有标记了荧光报告基团的RNA链；将ATP、Csm复合体、Csm6蛋白、核酸样本与所述基底接触反应，反应结束后冲洗所述基底；所述Csm复合体为丧失RNA剪切活性的突变体；利用全内反射荧光显微镜对反应前后的所述基底分别采集荧光信号，根据荧光强度变化得到所述核酸样本中的靶核酸浓度。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Csm复合体和所述Csm6蛋白来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述Csm复合体的Csm3具有D34A突变。4.根据权利要求1至3任一项所述的检测方法，其特征在于，还包括将所述ATP、所述Csm复合体与所述核酸样本接触反应，检测产物浓度，换算得到所述靶核酸浓度的步骤，所述产物选自氢离子、焦磷酸盐中的至少一种。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，检测氢离子的方法为：在反应体系中加入pH敏感性染料，根据染料变色情况，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘畅悦，秦培武，何倩，袁曦，陈群，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：