基于CRISPR-Cas反式切割和gFET核酸检测制造技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR
‑
Cas反式切割和gFET核酸检测


[0001]本专利技术涉及生物检测
，特别是涉及一种基于CRISPR
‑
Cas13a/Cas12a反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法。

技术介绍

[0002]针对病毒感染及疾病诊断，快速灵敏的核酸检测技术十分关键。目前，RT
‑
qPCR是核酸检测的金标准，该方法可实现高灵敏、高特异的疾病诊断。但是，RT
‑
qPCR的检测过程需要专业人员进行多步的样品处理和控温设备进行多个周期的反应，限制了RT
‑
qPCR在现场检测中的应用。
[0003]近年来，CRISPR
‑
Cas系统由于其多样性和Cas蛋白特殊的核酸酶活性，在生物传感器的开发中展现出巨大的潜力。其中，Cas12a和Cas13a具有独特的反式切割活性，近年来被广泛地应用于生物传感领域。目前，基于Cas12a/Cas13a的高灵敏核酸检测方式主要依赖于核酸等温扩增技术，但存在反应系统复杂、检测时间长以及样品易污染本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸检测方法，其特征在于，其使用场效应晶体管放大溶液中Cas13a/Cas12a反式切割的检测信号。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括场效应晶体管的制备步骤、报告分子修饰步骤以及核酸检测步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述场效应晶体管的制备步骤包括：定制商业化gFET芯片，经引线后，构建聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控腔室，将微流控腔室用环氧树脂胶固定于芯片上，并将进液和出液管道插入腔室，用胶封保证腔室密闭，出液管另一端与泵相连，用于液体的抽吸。4.根据权利要求2所述的方法，其中报告分子修饰步骤包括将PBASE溶液在石墨烯通道表面孵育1
‑
2h、将氨基修饰的ssRNA或ssDNA溶液在石墨烯表面孵育2
‑
12h，以及可选的用乙醇胺进行封闭1h。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述PBASE溶液浓度为1
‑
3mM；和/或氨基修饰的ssRNA或ssDNA溶液浓度为1
‑
5μM；和/或乙醇胺溶液浓度为100
‑
500mM；6.根据权利要求4所述的方法，所述ssRNA或ssDNA的长度为10
‑
30nt的随机序列。7.根据权利要求4所述的方法，所述PBASE溶液溶剂为乙醇或DMF。8.根据权利要求2所述的方法，其中所述的核酸检测步骤包括将Cas12a或Cas13a与crRNA形成复合物，将检测样本与复合物混合后添加到场效应晶体管中，反应后记录转移特性曲线的变化。9.根据权利要求8所述的方法，所述Cas13a/Cas12a的浓度为40
‑
60nM,反应条件为25
‑
37℃下反应30
‑
180min。10.根据权利要求8所述的方法，其中检测的对象可选SARS
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CoV
‑
2N基因、SARS
‑
CoV
‑
2E基因、SARS
‑
CoV
‑
2Orf1ab基因、HPV
‑
16或HPV
‑
18；优选地，crRNA序列选自SEQ ID NO.1
‑
5。11.一种核酸检测方法，其特征在于，其使用场效应晶体管放大固定于石墨烯表面Cas13a/Cas12a反式切割的检测信号。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法包括Cas13a/Cas12a和报告分子修饰步骤、Cas13a/Cas12a
‑
crRNA复合体的构建步骤以及核酸检测步骤。13.根据权利要求12所述的方法，其中Cas13a/Cas12a和报告分子修饰步骤包括将PBASE溶液在石墨烯通道表面孵育1
‑
2h、MgCl2溶液清洗、将PEG和氨基修饰的...

【专利技术属性】
技术研发人员：符汪洋，秦怡，经求是，王乾龙，张晓艳，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：