用于检测外周T细胞淋巴瘤相关基因突变的数字PCR试剂盒及引物和探针制造技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，具体讲，涉及一种用于检测外周T细胞淋巴瘤相关基因突变的数字PCR试剂盒及引物和探针。试剂盒中含有PCR扩增试剂和对照品，PCR扩增试剂中含有用于检测突变位点RHOA G17V和IDH2

Digital PCR kit, primers and probes for detecting mutations in peripheral T-cell lymphoma related genes

【技术实现步骤摘要】
用于检测外周T细胞淋巴瘤相关基因突变的数字PCR试剂盒及引物和探针


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，具体讲，涉及一种用于检测外周T细胞淋巴瘤相关基因突变的数字PCR试剂盒及引物和探针。

技术介绍

[0002]淋巴瘤是全球发病率最高的血液系统恶性肿瘤，具有种类多样、分型复杂的特点。在我国癌症发病率的统计中(Cancer Statistics in China,2015)位列前十，年发病率达到6.78每10万人，年因病死亡率为5.21每10万人。作为异质性很强的疾病，传统的淋巴瘤分类主要依托于病理形态、免疫组化、细胞遗传学和单基因突变的检测方法，对淋巴瘤细胞来源及恶性程度进行判断。根据对淋巴瘤的认识及多参数的分类方法，大体上可以分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin
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s Lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non
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Hodgkin
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s Lymphoma,NHL)两大类，后者又可以进一步根据免疫细胞来源分为如B细胞非霍奇金淋巴瘤或T细胞非霍奇金淋巴瘤等不同类别。
[0003]外周T细胞淋巴瘤(PTCL)是一组来源于成熟、胸腺后T细胞的罕见的异质性淋巴系统恶性疾病，PTCL的发病率在全世界有着显著的地域差异。PTCL在美国约占非霍奇金淋巴瘤(NHL)发病率的6
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10％，是一组异质性淋巴瘤，绝大部分具有侵袭性的临床病程。根据最新的WHO 2016造血与淋巴组织肿瘤分类，PTCL包含29个亚型。PTCL发病率低，诊断困难，即使在发达国家也存在极高的误诊率。中国PTCL约占非霍奇金淋巴瘤(NHL)的25％
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30％，显著高于欧美国家的10％
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5％。生物学行为和临床呈现高度的异质性和侵袭性，病情发展迅速，缺乏高效、特异的治疗手段，预后较差。根据WHO分型(2016年)可以将PTCL氛围至少29种亚型，其中最为常见的是外周T细胞淋巴瘤
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非特指型(PTCL
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NOS)、血管免疫母T细胞淋巴瘤(AITL)、间变大细胞淋巴瘤(ALCL、NK/T细胞淋巴瘤(ENKL)和成人T细胞淋巴瘤/白血病(ATLL)。根据不同的PTCL的亚型，在临床上也有着不同的临床特征、遗传学改变和治疗反应，因此给临床诊断和治疗带来了极大的困难。
[0004]初治PTCL最常用的一线治疗方案为CHOP(环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松)和CHOP样方案。但是除ALK
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ALCL外，整体治疗发难对其他病理亚型的治疗疗效均较差，5年的生产率仅为30％。针对这类具有难治复发潜能的患者，需要在CHOP方案的基础上，或治疗达到缓解后，尽早采取自体造血干细胞移植，改善部分患者的长期预后。但是多数患者因未能取得缓解或体能情况等原因无法接受造血干细胞移植。对于复发或难治性PTCL，我国根据2018年版西达本胺治疗外周T细胞淋巴瘤中国专家共识建议使用组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂联合传统化疗方案，并已在PTCL治疗中取得了显著的成果，目前我国药品监督管理局(NMPA)批准了新型HDAC抑制剂西达本胺(chidamide，爱谱沙)的上市使用。
[0005]由于PTCL组织学分类的复杂性，给临床判断带来了极大的挑战。组织活检可以使临床表现不典型的PTCL患者获得确诊，但是对病理医师的经验以及密切结合患者临床信息
对准确诊断和分型有着较高要求。随着生物学技术的发展，淋巴瘤的诊断并不限于病理形态学(Morphology)和免疫表型学(Immunophenotype)，细胞遗传学(Cytogenetics)和分子生物学(Molecular biology)检测在诊断和分子分型中正逐渐开始发挥越来越重要的作用，形成了淋巴瘤的MICM分型体系。不仅能够有助于更好的区分PTCL各个亚型，也为基于分子学异常的个体靶向治疗奠定了理论基础。
[0006]RHOA是小G蛋白的RAS超家族中RHO亚家族的一个重要成员，是重要的细胞内信号分子，通过其催化活性来调节肌动蛋白的聚集和收缩，在肿瘤迁移和侵袭中发挥重要作用。RHOA基因编码区第50位碱基G突变成了T，是导致其蛋白发生了一个Gly
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Val的转变(RHOA G17V)。在常见的PTCL亚型中，如PTCL
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NOS和AITL/PTCL
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TFH中，RHOA G17V都是显著常见的分子生物学改变，特别是在AITL中为常见的重现性基因突变占比高达近45％。针对血管免疫细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)和其他外周T细胞淋巴瘤(PTCL)的患者预后极差，对RHOAG17V位点进行检测分析将对患者治疗方案的选择起到重要的意义。
[0007]异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase，IDH)是参与细胞能量代谢的三羧酸循环中的限速酶，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α
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酮戊二酸(α
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Ketoglutarate，α
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KG)及CO2。人体中有3种IDH酶，分别是细胞质中的NADP
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IDH1，线粒体中的NADP
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IDH2和线粒体中的NAD
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IDH3。其中，IDH1/2是人类癌症中代谢基因(metabolic genes)发生突变频率最高的，并干扰细胞新陈代谢和表观遗传调控，从而促进肿瘤发生。肿瘤细胞中IDH突变(IDH1m和IDH2m)会导致其正常功能缺失，并将α
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KG转化为致癌代谢物2
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羟基戊二酸(2HG)，2HG在突变的肿瘤细胞中累积，导致DNA或组蛋白过甲基化。IDH2基因突变时AITL中常见的重现性基因突变，占比达到25％。
[0008]近年来，高通量测序结果表明，60％
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70％的AITL具有RHOA G17V突变，而在PTCL
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NOS中RHOA G17V的发生率不足20％，ALCL及ENKL中不具有RHOA G17V突变。RHOA G17V的出现，为AITL的诊断和鉴别诊断提供了有力的工具。此外20
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30％的IDH2 R172突变，而PTCL
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NOS及其他外周T细胞不具有此突变。因此，RHOA G17V、IDH R172突变的检测有助于AITL的诊断与鉴别诊断。
[0009]目前，临床中多采用二代测序技术对淋巴瘤患者生物学样本进行靶向基因检测，以选择最适治疗方案、实现精准化治疗。但是，经济成本高、检测周期长成为二代测序技术服务于淋巴瘤患者特别是难治复发的外周T细胞淋巴瘤患者的临床用药指导的绊脚石。特别是在外周T细胞淋巴瘤中AITL预后具有很强的异质性。所以早期预测患者的对于一线治疗的反应以及监测疾病的早期复发对于判断患者预后、及时调整治疗策略至关重要。近年来，使用循环肿瘤DNA进行疗效监测已成为监测肿瘤治疗疗效的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测外周T细胞淋巴瘤相关基因突变的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有PCR扩增试剂和对照品，所述PCR扩增试剂中含有用于检测突变位点RHOA G17V和IDH2
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R172的引物和探针，优选的，所述引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示；所述探针的序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:10所示。2.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述探针的5
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端连接有荧光报告基团，3
’
端连接有荧光淬灭基团，荧光报告基团选自VIC或FAM，荧光淬灭基团选自MGB；优选的，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7的5
’
端连接有VIC，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10的5
’
端连接有FAM。3.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为0.17～0.5μmol/L，优选为0.35μM；所述探针的浓度为0.12～0.24μmol/L，优选为0.18μM。4.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:20所示的片段化质粒标准品；阴性对照为无核酸酶水。5.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所适用的样本选血浆标本或石蜡标本。6.如权利要求1～5任一项所述的数字PCR试剂盒的使用方法，其特征在于，至少包括以下步骤：S1、样品处理：采用商业化提取试剂盒对样品进行提取，得到样品处理液；S2、配制数字PCR反应混合液：将所述数字PCR反应液与所述样品处理液混合，得到数字PCR反应混合液...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建勇，缪祎，朱华渊，范磊，乔纯，徐卫，肖晓，刘以哲，
申请(专利权)人：武汉思泰得医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：