一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提出了一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒及其使用方法，试剂盒包括检测A1762T和G1764A两个突变位点的引物和探针、HBV野生型引物和探针、内参引物和探针、PCR反应混合液、阳性对照和阴性对照。检测A1762T和G1764A两个突变位点的引物自5'端第15位和第20位碱基加入锁核酸修饰。检测A1762T突变位点的上游引物自5'端第21位设置1个碱基错配；检测G1764A突变位点的下游引物自5'端第20位和第22位分别设置1个碱基错配。本发明专利技术通过ARMS

【技术实现步骤摘要】
一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]乙型肝炎(HBV)是严重威胁我国人民健康的病毒性传染病之一，在HBV持续感染过程中，其基因组DNA可出现各种变异，其变异率远远高于其它DNA病毒。核心启动子(BCP)区是HBV前C区mRNA转录的重要元件，BCP区的突变在病毒复制、表达及致病等方面有着重大意义。BCP区的突变形式包括T1753A/C、A1762T、G1764A等，其中以1762
‑
1764双联突变最为常见。与野生株相比，BCP区变异株由于病毒复制水平提高，逃脱机体的免疫监视而具有更强的致病性，同时变异株对抗病毒药物产生耐药性，其结果一方面引起持续感染而不断诱导肝细胞炎性损害，降低肝脏功能贮备，并增加产生新的HBV基因突变的机会；另一方面突变病毒毒力的增强和抗原表位的改变，可以引起过度免疫应答反应，造成严重的肝细胞损伤，导致乙肝慢性化、重症化，甚至癌变。因此早期诊断BCP突变对于乙肝治疗和肝癌防治具有重大意义。
[0003]目前BCP区的突变的检测方法包括荧光PCR和测序法等。其中由于BCP区突变以点突变为主，虽然荧光PCR检测具有较高的灵敏度，但是其对单一核酸突变的区分性较差，不能很好的区分野生型和突变型，容易造成假阴性。测序法则具有准确性高，可区分具体突变型的优点，但是其操作极其繁琐，一次测序包含多次PCR、纯化等操作，耗时常在1天以上，且对实验人员的技术要求较高，本专利技术旨在开发一种用于BCP区突变检测的数字PCR技术，通过ARMS
‑
PCR引物设计技术和锁核酸技术，提高突变检测的准确性，同时与测序法相比操作更为简便。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术提出了可用于检测血清或血浆中的HBV病毒BCP区1762/1764突变，且具有较高的灵敏度和特异性的一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒及其使用方法。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，包括检测A1762T和G1764A两个突变位点的引物和探针；
[0006]所述检测A1762T突变位点的引物和探针序列如SEQ ID NO:1
‑
3所示；检测G1764A突变位点的引物和探针序列如SEQ ID NO:4
‑
6所示；
[0007]检测A1762T突变位点的上游引物自5'端第21位设置1个碱基错配，错配方式为A
‑
T互换；检测G1764A突变位点的下游引物自5'端第20位和第22位分别设置1个碱基错配，错配方式分别为A
‑
C互换，G
‑
T互换。
[0008]在以上技术方案的基础上，优选的，检测A1762T和G1764A突变位点的上下游引物
自5'端第15
‑
20位的一个碱基或多个碱基均加入锁核酸修饰。
[0009]在以上技术方案的基础上，优选的，还包括HBV野生型引物和探针，引物和探针序列如SEQ ID NO:7
‑
9所示。
[0010]在以上技术方案的基础上，优选的，所述检测A1762T和G1764A两个突变位点的探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1猝灭基团；所述HBV野生型探针的5'端标记FAM荧光基团，3'端标记BHQ2猝灭基团。
[0011]在以上技术方案的基础上，优选的，还设置有内参引物和探针，所述内参为根据人描定蛋白重复区域53所设计，所述内参引物和探针的序列如SEQ ID NO:10
‑
12所示。
[0012]在以上技术方案的基础上，优选的，所述内参探针的5'端标记VIC荧光基团，3'端标记BHQ2猝灭基团。
[0013]在以上技术方案的基础上，优选的，还包括PCR反应混合液、阳性对照和阴性对照。
[0014]在以上技术方案的基础上，优选的，所述PCR反应混合液包括如SEQ ID NO:1
‑
12所示的引物和探针，2
×
ddPCR Supermix for Probes；阳性对照为含有A1762T和G1764A双个突变位点的HBV DNA片段的质粒，阴性对照为阴性血清。
[0015]在以上技术方案的基础上，优选的，所述如SEQ ID NO:1
‑
12所示的引物和探针的浓度均为10μmol/L，其中如SEQ ID NO:1
‑
2、4
‑
5所示的引物用量均为1μL，如SEQ ID NO:3、6所示的探针用量均为0.8μL；如SEQ ID NO:7
‑
8所示的引物用量均为0.9μL，如SEQ ID NO:9所示的探针用量为0.4μL；2
×
ddPCR Supermix for Probes用量为10μL。
[0016]在以上技术方案的基础上，优选的，本专利技术还提供了一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0017]S1，提取样本DNA；
[0018]S2，配置数字PCR反应液：每个反应管加15μLPCR反应混合液和5μL样本；
[0019]S3，制备微滴，PCR扩增，扩增步骤：95℃变性10min；94℃退火15s；58℃延伸60s，退火
‑
延伸共40个循环；98℃ 10min，4℃ 5min，结束反应；
[0020]S4，使用微滴读取仪进行微滴读取和分析。
[0021]本专利技术的一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒及其使用方法相对于现有技术具有以下有益效果：
[0022](1)本专利技术通过ARMS
‑
PCR引物设计技术和锁核酸技术，提高了基因突变检测的准确性，同时与测序法相比操作更为简便。
[0023](2)本专利技术试剂盒可准确区分野生型与突变型，检测限可达到20copies/μL即5copies/反应，且与理论结果的差异程度小于15％，其准确性、重复性和特异性均较高。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1：阳性样本稀释至1000copies/μL时，1762突变型通道检测结果图；
[0026]图2：阳性样本稀释至1000copies/μL时，1764突变型通道检测结果图；
[0027]图3：阳性样本稀释至10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种HBV BCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：包括检测A1762T和G1764A两个突变位点的引物和探针；所述检测A1762T突变位点的引物和探针序列如SEQ ID NO:1
‑
3所示；检测G1764A突变位点的引物和探针序列如SEQ ID NO:4
‑
6所示；检测A1762T突变位点的上游引物自5'端第21位设置1个碱基错配，错配方式为A
‑
T互换；检测G1764A突变位点的下游引物自5'端第20位和第22位分别设置1个碱基错配，错配方式分别为A
‑
C互换，G
‑
T互换。2.如权利要求1所述的一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：检测A1762T和G1764A突变位点的上下游引物自5'端第15
‑
20位的一个碱基或多个碱基均加入锁核酸修饰。3.如权利要求1所述的一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括HBV野生型引物和探针，引物和探针序列如SEQ ID NO:7
‑
9所示。4.如权利要求3所述的一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述检测A1762T和G1764A两个突变位点的探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1猝灭基团；所述HBV野生型探针的5'端标记FAM荧光基团，3'端标记BHQ2猝灭基团。5.如权利要求3所述的一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：还设置有内参引物和探针，所述内参为根据人描定蛋白重复区域53所设计，所述内参引物和探针的序列如SEQ ID NO:10
‑
12所示。6.如权利要求5所述的一种HBVBCP区1762/1764突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊慧，高峰英，肖樊，
申请(专利权)人：武汉思泰得医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：