乙肝病毒DNA快速定量引物探针及其CRISPR/Cas12b检测系统技术方案

本发明专利技术公开了一种乙肝病毒DNA快速定量引物探针及其CRISPR/Cas12b检测系统。本发明专利技术基于CRISPR/Cas12b系统，在单管里先是通过环介导等温扩增实现目的基因的富集，然后CRISPR/Cas12b系统识别目的基因，激活Cas12b蛋白酶反式切割活性，无差别切割单链DNA分子（包括单链DNA荧光探针），从而发出荧光。本发明专利技术的检测系统操作简便，反应快速，灵敏度特异性高，成本较低，可克服传统PCR法检测HBV对场地和人员要求的限制，适合用于社区或医院进行乙肝病毒DNA大规模筛查或定量检测。大规模筛查或定量检测。

【技术实现步骤摘要】
乙肝病毒DNA快速定量引物探针及其CRISPR/Cas12b检测系统


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及乙肝病毒DNA快速定量引物探针及其CRISPR/Cas12b检测系统。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒是一种双链DNA嗜肝病毒，通过血液和其它体液传播，难以通过机体自身免疫彻底清除，危害极大。乙型肝炎病毒感染可以导致肝脏相关疾病，如慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌，已成为全世界范围内备受关注的严重健康问题。通常，血清中HBV DNA含量被认为是评估慢性乙型肝炎治疗效果的重要指标。因此，准确地定量检测血清HBV DNA对HBV感染诊断具有重要意义。
[0003]目前临床上最常用的HBV DNA定量方法是高灵敏的荧光定量聚合酶链式反应（real
‑
time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）。但该方法需要昂贵的设备、专业的操作人员和专业的PCR实验室，容易因气溶胶产生假阳性，不仅成本较高，还不易于基层单位的应用推广。
[0004]CRISPR/Cas诊断系统是成为近年来新兴的诊断平台，因其灵敏度高特异性强，广泛应用于病原体（人乳头瘤病毒、寨卡病毒、登革热病毒、大肠杆菌等）、游离肿瘤DNA、甲基化等方面的检测。一定温度下，Cas12蛋白酶在介导RNA引导下，识别DNA靶标后激活其旁路切割活性，可无差别化切割单链DNA报告分子，输出信号（荧光\浑浊度\纸层析等）。其中，Cas12b蛋白酶因可耐受较高温度（48~60℃），能够与反应温度较高的环介导等温扩增（loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP）相结合，实现临床样本经简单预处理后直接用于扩增检测，也可实现单管一步法，操作简便，不易污染，该方法称为一小时低成本多用途高效检测系统（one
‑
hour low
‑
cost multipurpose highly efficient system，HOLMESv2），已实现在单核苷酸多态性（SNP）、RNA（virus RNA、mRNA、circular RNA）、甲基化等方面的定性/定量检测。
[0005]基于上述情况，开发一种操作更加简便、成本低、灵敏特异、反应快的HBV DNA检测方法具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对上述问题，提供了一种乙肝病毒DNA快速定量引物、探针及其CRISPR/Cas12b检测系统。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种乙肝病毒DNA快速定量引物及探针，包括：特异性引物、单链DNA荧光探针和介导RNA；所述异性引物为F3、B3、FIP、BIP、LF、LB，具体序列如下：F3：5
’‑
TCCTCACAATACCGCAGAGT
‑3’
；B3：5
’‑
GCAGCAGGATGAAGAGGAAT
‑3’
；
FIP：5
’‑
GTTGGGGACTGCGAATTTTGGCTTTTTAGACTCGTGGTGGACTTCT
‑3’
；BIP：5
’‑
TCACTCACCAACCTCCTGTCCTTTTTAAAACGCCGCAGACACAT
‑3’
；LF：5
’‑
GGTGATCCCCCTAGAAAATTGAG
‑3’
；LB：5
’‑
AATTTGTCCTGGTTATCGCTGG
‑3’
。
[0008]所述单链DNA荧光探针序列为5
’‑
FAM
‑
TTTTT
‑
BHQ1
‑3’
；所述介导RNA序列为：5
’‑
GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACGCAGUCCCCAACCUCCAAUC
‑3’
。
[0009]一种包含上述乙肝病毒DNA快速定量引物及探针的试剂盒。
[0010]上述试剂盒在检测乙肝病毒DNA中的应用。
[0011]一种由上述乙肝病毒DNA快速定量引物及探针组成的乙肝病毒DNA CRISPR/Cas12b检测系统，所述检测系统的反应体系为10微升，包括：0.5
×
Isothermal Amplification buffer、0.5
×
NEBuffer 2.1、6 mM MgSO4，1.4 mM dNTP，0.2 uM F3/B3，1.6 uM FIP/BIP，0.4 uM LF/LB，0.32 U/uL Bst 2.0 WarmStart
®ꢀ
DNA Polymerase，10 uM介导RNA，50 nM单链DNA荧光探针，0.5 uM AapCas12b，模板DNA；所述0.5
×
Isothermal Amplification buffer包括：10 mM Tris
‑
HCl，5 mM (NH4)2SO4，25 mM KCl，1 mM MgSO4，0.05% Tween
®ꢀ
20，pH 8.8；所述0.5
×
NEBuffer 2.1包括：25 mM NaCl，5 mM Tris
‑
HCl，5 mM MgCl2，50
ꢀµ
g/ml BSA，pH 7.9；所述检测系统的反应条件为：体系反应温度为58~62℃反应1
‑
2小时。
[0012]进一步的，所述所述检测系统的反应条件为：体系反应温度为60℃反应1小时。
[0013]上述检测系统在乙肝病毒DNA 检测中的应用。
[0014]本专利技术乙肝病毒DNA 的检测原理（如图1）：本专利技术基于CRISPR/Cas12b系统，在单管里先是通过环介导等温扩增（特异性引物F3、B3、FIP、BIP、LF、LB）实现目的基因的富集，然后CRISPR/Cas12b系统识别目的基因，激活Cas12b蛋白酶反式切割活性，无差别切割单链DNA分子（包括单链DNA荧光探针），从而发出荧光。
[0015]本专利技术的有益之处在于：本专利技术公开了乙肝病毒DNA快速定量引物探针及其CRISPR/Cas12b检测系统。本专利技术基于CRISPR/Cas12b系统，先是通过环介导等温扩增实现目的基因的富集，然后CRISPR/Cas12b系统识别目的基因，激活Cas12b蛋白酶反式切割活性，无差别切割单链DNA分子，从而发出荧光。本专利技术检测系统操作简便，反应快速，灵敏度高，特异性强，成本较低，克服了传统PCR法检测HBV对场地和人员要求的限制，适合用于社区或医院进行乙肝病毒DN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乙肝病毒DNA快速定量引物及探针，其特征在于：所述引物及探针包括：特异性引物、单链DNA荧光探针和介导RNA；所述特异性引物为F3、B3、FIP、BIP、LF、LB，具体序列如下：F3：5
’‑
TCCTCACAATACCGCAGAGT
‑3’
；B3：5
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GCAGCAGGATGAAGAGGAAT
‑3’
；FIP：5
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GTTGGGGACTGCGAATTTTGGCTTTTTAGACTCGTGGTGGACTTCT
‑3’
；BIP：5
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TCACTCACCAACCTCCTGTCCTTTTTAAAACGCCGCAGACACAT
‑3’
；LF：5
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GGTGATCCCCCTAGAAAATTGAG
‑3’
；LB：5
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AATTTGTCCTGGTTATCGCTGG
‑3’
；所述单链DNA荧光探针序列为5
’‑
FAM
‑
TTTTT
‑
BHQ1
‑3’
；所述介导RNA序列为：5
’‑
GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACGCAGUCCCCAACCUCCAAUC
‑3’
。2.一种包含权利要求1所述乙肝病毒DNA快速定量引物及探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小龙，许海坡，曾永毅，蔡志雄，孙宇鹏，
申请(专利权)人：福建医科大学孟超肝胆医院福州市传染病医院，
类型：发明
国别省市：