靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备与应用制造技术

本发明专利技术提供一种靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备方法，包括：S1，将质粒、Lentiviral Mix和转染试剂进行共转染293T细胞，然后收集病毒液；S2，制备目的蛋白高表达干细胞；S3，采用S2得到的干细胞培养提取外泌体；S4，取si

【技术实现步骤摘要】
靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备与应用


[0001]本专利技术涉及一种生物医药
，尤其是涉及一种可精准靶向肿瘤递送基因药物的干细胞外泌体的制备和应用。

技术介绍

[0002]迄今为止，部分癌症仍然难以治愈。目前的治疗手段中，手术与放射治疗均不适用于广泛转移的患者。化疗通过注射药物进入血液循环以对抗全身癌细胞，但同时对正常细胞杀伤较大。近年来，应用靶向技术向肿瘤区域精确递送药物的“靶向治疗”和利用肿瘤特异的信号传导或特异代谢途径控制的“靶点治疗”获得越来越多的医生和学者的关注。提高载体的靶向性具有重大意义，近年来，间充质干细胞的特殊的“归巢性”引起关注，且MSCs广泛地分布于全身多种组织，如骨髓、脂肪组织、肝脏、胎盘、脐带血、脐带组织等，是良好的靶向载体。细胞归巢，最终归巢至骨髓，归巢至各个脏器，归巢至炎症及创伤部位，甚至归巢至肿瘤部位。研究表明，骨髓，血液和健康的组织和器官中都有它们的存在。简而言之，某些特定信号分子与MSCs膜上相应受体结合，共同驱动其归巢行为。移植的干细胞顺利归巢至微环境，这要求损伤部位的信号分子和MSCs表面受体相一致。参与归巢行为的小组成员很多，有诸如趋化因子、生长因子和黏附分子等。趋化因子主要负责由远及近。特定的组织分泌特定的趋化因子，并且通过趋化因子的浓度梯度，吸引带有趋化因子受体的细胞定向到达该组织。在损伤过程中，不同组织细胞能释放不同的化学趋化因子，这些趋化因子能促进MSCs迁移。
[0003]MSC治疗瓶颈在于MSCs有可能在一定程度上促进肿瘤转移，而外泌体无增增殖能力。基于间充质干细胞特殊“归巢性”及其较强的外泌体分泌能力，干细胞来源外泌体作为靶向治疗药物载体具有巨大潜力。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备与应用。
[0005]根据本专利技术的一个方面，提供一种靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备方法，包括：
[0006]S1，慢病毒液的制备：将质粒、Lentiviral Mix和转染试剂进行共转染293T细胞，然后收集病毒液；
[0007]S2，制备目的蛋白高表达干细胞：对干细胞进行培养，用S1收集的病毒液感染培养后的干细胞，再加入聚凝胺培养，然后筛选获得稳定感染的细胞株；
[0008]S3，采用S2得到的干细胞培养提取外泌体：将S2获得的细胞株培养后离心，所得上清液再加入缓冲层后进行第一次超速离心，收集靠近缓冲层的溶液；再将收集的溶液加入缓冲层后进行第二次超速离心，收集缓冲层中的颗粒，即得外泌体；
[0009]S4，制备装载siRNA的外泌体：取si
‑
Survivin与上述S304所得外泌体混合，进行电
转，然后冰上孵育，即得到载有si
‑
Survivin的外泌体。
[0010]在本专利技术一些实施例中，所述S1，具体包括：
[0011]S101，在培养皿中接种293T细胞，待细胞融合度达到转染要求；
[0012]S102，将无血清培养基、质粒、慢病毒混合物和转染试剂混匀后放置室温，滴加到S101接种293T细胞的培养皿中培养过夜后吸弃上清，用PBS轻轻洗细胞，加入DMEM高糖培养基；
[0013]S103，将S102加入DMEM高糖培养基的293T细胞，继续培养一段时间后，离心，上清液使用滤器过滤后即为病毒液。
[0014]在本专利技术一些实施例中，所述S1，还包括以下一种或多种选择：
[0015]‑
S101中，接种的293T细胞为4
×
106‑6×
106个；
[0016]‑
S102中，采用0.5
‑
5ml无血清培养基，质粒的量为5
‑
15μg，Lentiviral Mix用量为5
‑
20μg，转染试剂采用HG Transgene
TM Reagent，HG Transgene
TM Reagent用量为40
‑
80μg；
[0017]‑
S102中，混匀后放置室温的时间为5
‑
30min；
[0018]‑
S103中，在37℃，5％CO2培养一段时间后，4℃，500g
‑
2000g离心，上清液使用0.45μm滤器过滤后即为病毒液。
[0019]在本专利技术一些实施例中，所述S2，具体包括：
[0020]S201，培养干细胞，培养后弃培养基；
[0021]S202，用S1中收集的病毒液感染培养后的干细胞，再加入聚凝胺，培养一段时间后，加嘌呤霉素筛选阳性克隆，扩增稳定感染的细胞株。
[0022]在本专利技术一些实施例中，所述S2还包括以下一种或多种选择：
[0023]‑
所述干细胞为间充质干细胞第5
‑
6代，所述干细胞生长密度为60％
‑
70％；
[0024]‑
所述间充质干细胞的接种量为5
×
105，培养时间12
‑
48h；
[0025]‑
所述病毒液感染细胞MOI值为50
‑
400；
[0026]‑
所述聚凝胺的浓度为1
‑
20μg/mL；
[0027]‑
所述嘌呤霉素的浓度为0.5
‑
1μg/mL；
[0028]‑
所得到的干细胞表面目的蛋白表达量为原始干细胞的200
‑
300倍。
[0029]在本专利技术一些实施例中，所述S3，具体包括：
[0030]S301，将S2获得的细胞株放入条件培养基培养，再将条件培养基放入离心管进行离心，沉淀为死细胞，丢弃沉淀，吸取上清，得到的上清液继续离心，沉淀为细胞碎片，丢弃沉淀，取上清；
[0031]S302，加入碘杂醇形成缓冲层，对S301所得上清进行第一次超速离心；
[0032]S303，经S302第一次超速离心后，外泌体迁移并浓缩到碘杂醇和上清液之间的界面层，收集靠近界面和缓冲层的部分；
[0033]S304，将S303收集到的液体加入PBS，放入含有碘化醇缓冲垫的离心管进行第二次超速离心，第二次超速离心后收集缓冲垫中所有颗粒，悬浮于无菌PBS中，即得到外泌体溶液。
[0034]在本专利技术一些实施例中，所述S3，还包括以下一种或多种选择：
[0035]‑
S301中，将条件培养基放入离心管进行离心，离心参数为：温度4℃，转速为2000g，时间为10
‑
30min；
[0036]‑
S301中，得到的上清液继续离心，离心参数为：4℃，转速为10000g，时间为20
‑
30min；
[0037]‑
S302中，所述碘杂醇与S301本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括：S1，慢病毒液的制备：将质粒、Lentiviral Mix和转染试剂进行共转染293T细胞，然后收集病毒液；S2，制备目的蛋白高表达干细胞：对干细胞进行培养，用S1收集的病毒液感染培养后的干细胞，再加入聚凝胺培养，然后筛选获得稳定感染的细胞株；S3，采用S2得到的干细胞培养提取外泌体：将S2获得的细胞株培养后离心，所得上清液再加入缓冲层后进行第一次超速离心，收集靠近缓冲层的溶液；再将收集的溶液加入缓冲层后进行第二次超速离心，收集缓冲层中的颗粒，即得外泌体；S4，制备装载siRNA的外泌体：取si
‑
Survivin与上述S304所得外泌体混合，进行电转，然后冰上孵育，即得到载有si
‑
Survivin的外泌体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1，具体包括：S101，在培养皿中接种293T细胞，待细胞融合度达到转染要求；S102，将无血清培养基、质粒、慢病毒混合物和转染试剂混匀后放置室温，滴加到S101接种293T细胞的培养皿中培养过夜后吸弃上清，用PBS轻轻洗细胞，加入DMEM高糖培养基；S103，将S102加入DMEM高糖培养基的293T细胞，继续培养一段时间后，离心，上清液使用滤器过滤后即为病毒液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S1，还包括以下一种或多种选择：
‑
S101中，接种的293T细胞为4
×
106‑6×
106个；
‑
S102中，采用0.5
‑
5ml无血清培养基，质粒的量为5
‑
15μg，Lentiviral Mix用量为5
‑
20μg，转染试剂采用HG Transgene
TM Reagent，HG Transgene
TM Reagent用量为40
‑
80μg；
‑
S102中，混匀后放置室温的时间为5
‑
30min；
‑
S103中，在37℃，5％CO2培养一段时间后，4℃，500g
‑
2000g离心，上清液使用0.45μm滤器过滤后即为病毒液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2，具体包括：S201，培养干细胞，培养后弃培养基；S202，用S1中收集的病毒液感染培养后的干细胞，再加入聚凝胺，培养一段时间后，加嘌呤霉素筛选阳性克隆，扩增稳定感染的细胞株。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述S2还包括以下一种或多种选择：
‑
所述干细胞为间充质干细胞第5
‑
6代，所述干细胞生长密度为60％
‑
70％；
‑
所述间充质干细胞的接种量为5
×
105，培养时间12
‑
48h；
‑
所述病毒液感染细胞MOI值为50
‑
400；
‑
所述聚凝胺的浓度为1
‑
20...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，刘彬，徐淑月，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：