一种用于分离牛肌肉干细胞的肌肉组织提取方法及其应用技术

本发明专利技术属于细胞工程技术领域，特别涉及一种用于分离牛肌肉干细胞的肌肉组织的提取方法及其应用。所述方法包括：(1)用酒精擦拭牛皮肤表面后采集牛背最长肌肌肉组织，立即用磷酸盐缓冲液漂洗；(2)然后将表面筋膜、白膜剔除干净；(3)先使用三蒸水中漂洗，再依次使用磷酸盐缓冲液、酒精、磷酸盐缓冲液漂洗。该提取方法不同于以往单一使用磷酸盐缓冲液进行处理，本发明专利技术三种洗涤液联合处理，降低了成本。然后将提取的肌肉组织分离肌肉干细胞用于构建超级增强子，在染色体免疫共沉淀高通量数据基础分析上，使用H3K4me1、H3K27ac双标记方法，优化形成用于牛肌肉超级增强子分析的方法，不同于现有技术的单一标记。技术的单一标记。技术的单一标记。

【技术实现步骤摘要】
一种用于分离牛肌肉干细胞的肌肉组织提取方法及其应用


[0001]本专利技术属于细胞工程
，特别涉及一种用于分离牛肌肉干细胞的肌肉组织提取方法及其应用。

技术介绍

[0002]肌肉发育是影响家畜的生长速度、产肉量、肉质等重要经济性状的重要因素，而肌肉发育依赖于肌肉干细胞(muscle stem cells，MuSCs)的增殖、成肌纤维分化功能。MuSCs是一种来自中胚层的间充质干细胞，其功能在肌肉生成过程中影响成肌细胞的数量、肌管融合而调节肌纤维肥大。由此可见，MuSCs在畜牧业的家畜精准改良、干细胞育种、体内外养殖肉类生产等新兴研究领域中扮演越来越重要的角色。同时，MuSCs的肌纤维分化还与肌肉萎缩、肌肉损伤等疾病密切相关。因此深度剖析肌肉发育中MuSCs功能的调控机制，对于畜牧业的发展以及肌肉发育相关疾病的治疗具有重要的研究意义。
[0003]在遗传学中，超级增强子(super enhancer，SE)是哺乳动物基因组的区域，其包含多个增强子，其由一系列转录因子蛋白共同结合，以驱动控制细胞身份基因的表达，从而在调控细胞命运中发挥重要作用。现有研究表明，在细胞转变过程中，SE受到动态调节，是肿瘤发生、免疫功能和肌肉分化等生物过程中潜在关键调节剂，具有识别关键靶基因作用和介导miRNA、lncRNA生成的生物学功能。另一方面，circRNA是SE转录调控产生的超级增强子RNA(seRNA)之一，使用SE标记方法能够快速鉴定调节细胞身份的关键circRNA。例如，骨骼肌细胞受到TNFα信号刺激下，增强子产生应答识别出控制代谢的基因；作为seRNA，circNifx是心脏再生的关键调节剂，是改善心肌梗死后心肌功能和预后的作用靶点(Huang et al.2019)。在癌症领域中，破坏SE结构直接靶向SE组分的治疗策略已显示出良好治愈作用。
[0004]现有研究表明，在细胞分化过程中，染色质开放性的变化对基因表达具有调控作用。当SE联合染色质开放区域时，可更好识别关键调控信息。因此，结合目前最新的ATAC
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seq技术，分析SE和染色质可及性交互修饰的区域，有助于筛选调控细胞功能关键基因。在肌肉发育中，有报道证实了CASZ1转录因子利用染色质可及性和SE交互修饰区域直接找到调控骨骼肌发育的基因。而Pax7也存在类似的现象，其通过启动子
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增强子关联作用找到了可能调控三维染色质构象的SE，预示染色质开放性在肌肉生成过程扮演着重要作用。
[0005]综上所述，SE在细胞分化上具有重要的调控作用。然而，驱动牛MuSCs成肌纤维分化的SE遗传景观有待被揭示；同时，SE与seRNA在MuSCs的交互对话参与肌肉发育调控的机制有待被研究，且SE在肌肉发育中是否具有调控染色质开放性的作用也有待被揭示。那么，在研究肌肉发育中MuSCs功能的调控机制时，需要将牛肌肉干细胞从牛肉肌肉组织中分离出来，然后构建肌肉干细胞增强启动子。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于提供一种提取牛肌肉组织的方法，所述牛肌肉组织用于分离牛肌
肉干细胞，该提取方法不同于以往单一使用磷酸盐缓冲液进行处理，本专利技术使用磷酸盐缓冲液、三蒸水、酒精联合处理，降低成本。
[0007]所述肌肉组织提取方法包括：(1)用70
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80％酒精擦拭牛皮肤表面，然后采集牛背最长肌肌肉组织，立即放入35
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38℃的磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次，每次25
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30s，并置于35
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38℃的磷酸盐缓冲液浸润；(2)将所述牛背最长肌肌肉组织表面筋膜、白膜剔除干净；(3)其次将所述牛背最长肌肌肉组织使用三蒸水中漂洗至少一次，再置于磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次，接着在70
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80％酒精中漂洗15
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20s，接着在磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次得所述牛肌肉组织。
[0008]进一步，本专利技术目的在前述提取牛肌肉组织的方法的基础上提供一种分离牛肌肉干细胞的方法。所述方法可以将牛肌肉干细胞很有效的从牛肌肉组织中分离出来。
[0009]所述方法包括：(a)按照前述提取牛肌肉组织的方法提取牛肌肉组织，然后切成碎粒，再用35
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38℃的磷酸盐缓冲液重悬、洗涤碎粒组织血丝，37℃恒温静置5min，去上清；(b)将所述切碎的牛肌肉组织制备成牛肌肉组织消化液；(c)将所述牛肌肉组织消化液分别使用70μm，40μm过滤器过滤组织液，离心收集细胞沉淀，并加入37℃磷酸盐缓冲液洗涤细胞以致进一步除去血丝，再次离心收集细胞沉淀得原代牛肌肉干细胞。
[0010]优选地，所述牛背最长肌肌肉组织来自胎牛。
[0011]优选地，所述胎牛为3
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4月龄胎牛。
[0012]进一步，步骤(b)中，将所述切碎的牛肌肉组织制备成牛肌肉组织消化液，分成两步法进行：第一步，在胶原酶溶液中添加中性酶Ⅱ，37℃、无菌摇床环境摇动消化；第二步，弃除胶原酶溶液，加入0.25％胰酶溶液，重悬混匀，37℃、无菌摇床环境摇动消化。
[0013]进一步，将所述原代牛肌肉干细胞进行原代培养，包括：将所述原代牛肌肉干细胞混匀、静置2h，再将上层细胞液继续培养，静置1
‑
1.5h，再转移上层细胞液继续培养；在两次培养过程中，使用原代培养基，所述原代培养基包括：糖分含量为0.5
‑
1.5g/L DMEM基础培养基，19
‑
21nM两性霉素,0.62
‑
0.63mg/mL庆大霉素，95
‑
105μl/mL青链霉素，胎牛血清，其体积比为39
‑
40mL：0.1
‑
1：0.1
‑
1：0.1
‑
1：9
‑
11。
[0014]进一步，在所述原代培养后进行传代培养，包括：使用牛肌肉干细胞普通培养基进行培养，所述牛肌肉干细胞普通培养基包括：含量为0.5
‑
1.5g/L DMEM基础培养基，95
‑
105μl/mL青链霉素，胎牛血清，其体积比为：44
‑
45：0.1
‑
1：4
‑
6。
[0015]进一步，将所述传代培养结束后的牛肌肉干细胞使用磷酸盐缓冲液洗涤，然后使用成肌分化诱导培养基进行培养诱导所述牛肌肉干细胞成肌；所述成肌分化诱导培养基包括：糖分含量0.5
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1.5g/L的DMEM基础培养基，95
‑
105μl/mL青链霉素，马血清，其体积比为48
‑
49:0.1
‑
1：0.5
‑
1.5。
[0016]进一步，将上述牛肌肉干细胞进行成脂诱导：待牛肌肉干细胞汇合度达80％时，吸走培养液，磷酸缓冲液轻轻洗2次，换入成脂诱导液1，每三天换一次液；6d后，换入成脂诱导液2，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于分离牛肌肉干细胞的肌肉组织提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：(1)用70
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80％酒精擦拭牛皮肤表面，然后采集牛背最长肌肌肉组织，立即放入35
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38℃的磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次，每次25
‑
30s，并置于35
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38℃的磷酸盐缓冲液浸润；(2)将所述牛背最长肌肌肉组织表面筋膜、白膜剔除干净；(3)其次将所述牛背最长肌肌肉组织使用三蒸水中漂洗至少一次，再置于磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次，接着在70
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80％酒精中漂洗15
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20s，接着在磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次得所述牛肌肉组织。2.一种分离牛肌肉干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)按照权利要求1所述的肌肉组织提取方法提取牛肌肉组织，然后切成碎粒，再用35
‑
38℃的磷酸盐缓冲液重悬、洗涤碎粒组织血丝，37℃恒温静置5min，去上清；(b)将所述切碎的牛肌肉组织制备成牛肌肉组织消化液；(c)将所述牛肌肉组织消化液分别使用70μm，40μm过滤器过滤组织液，离心收集细胞沉淀，并加入37℃磷酸盐缓冲液洗涤细胞以致进一步除去血丝，再次离心收集细胞沉淀得原代牛肌肉干细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述牛背最长肌肌肉组织来自胎牛。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胎牛为3
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4月龄胎牛。5.根据权利要求2
‑
4任一所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，将所述切碎的牛肌肉组织制备成牛肌肉组织消化液，分成两步法进行：第一步，在胶原酶溶液中添加中性酶Ⅱ，37℃、无菌摇床环境摇动消化；第二步，弃除胶原酶溶液，加入0.25％胰酶溶液，重悬混匀，37℃、无菌摇床环境摇动消化。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述原代牛肌肉干细胞进行原代培养，包括：将所述原代牛肌肉干细胞混匀、静置2h，再将上层细胞液继续培养，静置1
‑
1.5h，再转移上层细胞液继续培养；在两次培养过程中，使用原代培养基，所述原代培养基包括：糖分含量为0.5
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1.5g/L DMEM基础培养基，19
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21nM两性霉素,0.62
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0.63mg/mL庆大霉素，95

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑞门，杨素芳，韦英明，梁菁媛，邓彦飞，郑自华，王乐怡，安强，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：