一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法技术

本发明专利技术提供一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法，所述方法包括以下步骤：(1)分离、培养人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞，利用焦亡诱导液诱导其焦亡，并提取其焦亡囊泡(Pyrop

【技术实现步骤摘要】
一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体为一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法。

技术介绍

[0002]牙周炎和牙髓炎是口腔科常见病,牙周组织和牙髓组织在解剖上相通,可相互感染。原发的牙髓病变可通过这些解剖因素波及牙周组织，而牙周组织的病变也可能影响牙髓。这也就是牙周牙髓联合病变的解剖学基础。因此一旦牙周或牙髓发生联合病变，容易相互扩散和影响，往往病变破坏范围较大、病程较长且迁延不愈，治疗难度大、周期长、费用高且预后不确切，容易导致牙齿缺失的结局，是临床上一个较为棘手的问题。
[0003]细胞的程序性死亡分为细胞凋亡、细胞焦亡、程序性细胞坏死、铁死亡等等，细胞焦亡(Pyroptosis)通常是病原体感染时可能引发的细胞死亡的主要模式，其特征在于死亡细胞的破裂和由此产生的有效炎症诱导剂的释放，在细胞受感染的情况下还包括病原体及其不同成分，已有研究表明牙周炎的发生发展过程中伴随着焦亡的产生，此种效应导致了牙周膜干细胞的丧失、促进破骨细胞形成，加重了炎症程度；不仅如此，细胞焦亡还导致了根尖周炎的发生，并且焦亡的严重程度与根尖周炎的病情严重程度呈正相关。牙周牙髓联合病变作为口腔中较为严重的一种炎性疾病，其发生发展机制与焦亡及焦亡产物的相关性尚无报道。
[0004]细胞外囊泡是一组异质的细胞衍生膜结构，包括外泌体、微囊泡、凋亡小体等，存在于生物体液中并参与多种生理和病理过程。细胞外囊泡现在被认为是细胞间通讯的额外机制，允许细胞交换蛋白质、脂质和遗传物质。它介导的是一种远程的、长效的、低免疫原性的细胞间通讯新方式5，在细胞间通讯、疾病进展或作为生物标志物方面的作用引起了人们的极大兴趣。本课题组先前的研究发现细胞在焦亡的过程中会释放一些具有免疫调节功能的EVs，我们暂且称之为焦亡囊泡(Pyrop
‑
EVs)，并且已经成功在体外诱导牙周牙髓联合病变组织中的中间充质干细胞(MSCs)发生焦亡。
[0005]MSCs的免疫调节特性与炎症的状态有关，在轻微炎症中，MSCs发挥抗炎作用，有助于炎症的清除，而在严重的疾病环境中，MSCs也许发挥促炎作用，组织位置和炎性状态是MSCs免疫调节特性的关键决定因素。目前许多类型的人牙组织来源MSCs已被分离和表征，包括牙髓干细胞、脱落乳牙干细胞、牙周膜干细胞、牙囊祖细胞、牙槽骨来源的间充质干细胞、来自牙乳头的干细胞、牙胚祖细胞和牙龈间充质干细胞12。发现在牙周牙髓联合病变的肉芽组织中也存在MSCs，其形态与增殖分化能力都与正常的牙周膜干细胞无明显差异。
[0006]根据目前的研究，猜想在牙周牙髓联合病变这样一个炎性环境中，往往伴随着MSCs免疫调节特性的改变，目前从牙周牙髓联合病变的组织中已经成功分离出MSCs，分析此种炎性环境下MSCs的焦亡产物特性与探究牙周牙髓联合病变的致病机制密切相关。
[0007]因此应当认为，Pyrop
‑
EVs在牙周牙髓联合病变的炎性微环境下对于颌骨骨髓间
充质干细胞的免疫调节功能及成骨分化能力具有影响，研究牙周牙髓联合病变组织的中间充质干细胞焦亡囊泡的是否在牙周牙髓联合病变疾病进展中发挥重要作用及其具体机制是急需解决的科学问题。

技术实现思路

[0008]为解决
技术介绍
提出的上述问题，本专利技术提出一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法，所述方法包括以下步骤：(1)分离、培养人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞，利用焦亡诱导液诱导其焦亡，并提取其焦亡囊泡(Pyrop
‑
EVs)悬液；(2)分离、培养人颌骨骨髓干细胞，将焦亡囊泡(Pyrop
‑
EVs)以不同浓度梯度注射至人颌骨骨髓干细胞中共同培养，并检测其细胞的变化；(3)诱导小鼠溃疡性结肠炎后，将小鼠分为实验组和对照组，给实验组的小鼠注射不同浓度梯度的焦亡囊泡(Pyrop
‑
EVs)悬液，给对照组的小鼠注射PBS缓冲液，并检测实验组和对照组小鼠的各项生理指标。
[0010]优选的，所述步骤1中分离、培养人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞的方法为：选取根据临床体格检查及影像学资料，诊断为牙周牙髓联合病变，且无系统性疾病，身体状况良好的患者，拔除其患牙上附带的肉芽组织，剁碎、消化、培养、传代、冻存后使用。
[0011]优选的，所述步骤1中取P3代长势良好的人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞，加入焦亡诱导液诱导其焦亡后，并鉴定细胞确实发生焦亡，利用差速离心的方法，分离焦亡囊泡。
[0012]优选的，所述步骤2中分离、培养人颌骨骨髓干细胞的方法为：选取临床因正颌手术或牙槽突修整手术中废弃的健康颌骨，将其清洗、剪碎、离心、培养、传代、冻存后使用。
[0013]优选的，所述步骤2中取长势良好的人颌骨骨髓干细胞分为两组，根据浓度梯度加入焦亡囊泡(Pyrop
‑
EVs)悬液诱导24小时后；一组人颌骨骨髓干细胞，收集其上清液，提取上清液中的细胞蛋白后，进行ELISA(酶联免疫吸附实验)和WB(免疫印迹)检测；另一组人颌骨骨髓干细胞，用成骨诱导液及成脂诱导培养后，进行茜素红染色、油红O染色。
[0014]优选的，所述步骤2中ELISA(酶联免疫吸附实验)和WB(免疫印迹)检测时，检测细胞因子IL
‑
6或RUNX2或ALP中的一种或多种。
[0015]优选的，所述步骤3中通过含有2.5％dss的无菌水喂养小鼠，诱导其患溃疡性结肠炎。
[0016]优选的，所述步骤3中检测的实验组和对照组小鼠的生理指标包括：疾病活动指数、组织学损伤指数、免疫指标的变化。
[0017]优选的，所述步骤3中检测实验组和对照组小鼠的生理指标时，操作方法为：在疾病进展最严重的小鼠体重下降约30％左右时，同时处死所有小鼠，收集小鼠血清、结肠、脾脏、肠系膜淋巴结；检测血清里炎症相关细胞因子；结肠长度测量、结肠HE染色检测；脾脏研磨成单细胞悬液后，用流式细胞术检测淋巴细胞；肠系膜淋巴结用流式细胞术观察淋巴细胞的变化。
[0018]优选的，所述步骤1中诱导人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞焦亡的焦亡诱导
液由α
‑
MEM、LPS、nigericin配制而成。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0020]本专利技术提供的牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法，探究牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞焦亡囊泡的免疫调节功能影响及介导骨吸收机制，为寻找牙周牙髓联合病变的具体发生发展机制奠定基础，将来为发现口腔炎性病变致病因素提供新的见解，同时该方法整体步骤简单，易于操作。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(1)分离、培养人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞，利用焦亡诱导液诱导其焦亡，并提取其焦亡囊泡(Pyrop
‑
EVs)悬液；(2)分离、培养人颌骨骨髓干细胞，将焦亡囊泡(Pyrop
‑
EVs)以不同浓度梯度注射至人颌骨骨髓干细胞中共同培养，并检测其细胞的变化；(3)诱导小鼠溃疡性结肠炎后，将小鼠分为实验组和对照组，给实验组的小鼠注射不同浓度梯度的焦亡囊泡(Pyrop
‑
EVs)悬液，给对照组的小鼠注射PBS缓冲液，并检测实验组和对照组小鼠的各项生理指标。2.根据权利要求1所述的一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法，其特征在于：所述步骤1中分离、培养人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞的方法为：选取根据临床体格检查及影像学资料，诊断为牙周牙髓联合病变，且无系统性疾病，身体状况良好的患者，拔除其患牙上附带的肉芽组织，剁碎、消化、培养、传代、冻存后使用。3.根据权利要求1所述的一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法，其特征在于：所述步骤1中取P3代长势良好的人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞，加入焦亡诱导液诱导其焦亡后，并鉴定细胞确实发生焦亡，利用差速离心的方法，分离焦亡囊泡。4.根据权利要求1所述的一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法，其特征在于：所述步骤2中分离、培养人颌骨骨髓干细胞的方法为：选取临床因正颌手术或牙槽突修整手术中废弃的健康颌骨，将其清洗、剪碎、离心、培养、传代、冻存后使用。5.根据权利要求1所述的一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法，其特征在于：所述步骤2中取长势良好的人颌骨骨髓干细胞分为两组，根...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐健霞，于昕琦，王姗，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：