用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基及其制备方法技术

本发明专利技术公开了用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基及其制备方法，以DMEM/F12为基础培养基添加如下成分：10～22g/mL血清替代物、20～55ng/mL促生长因子、5～10ng/mL肌层细胞修复因子HCGF、5～16mM抗衰老因子、缓冲剂、0.5～3mg/L抗氧化剂、1～20mg/L维生素、抗生素、5～65mg/L微量元素、1～16μg/mL保护剂。本发明专利技术中，间充质干细胞培养基成分确定，不含血清成分，质量可控，能够规模化生产，用其进行干细胞体外培养，干细胞能够正常生长，而且，本发明专利技术间充质干细胞培养基有利于干细胞的分裂增殖，极大地提高干细胞扩增速率，缩短干细胞的培养时间，同时，采用本发明专利技术的培养基对干细胞进行多次传代次后，干细胞依然能够保持其原有的生物学特性和多向分化潜能。的生物学特性和多向分化潜能。

【技术实现步骤摘要】
用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基及其制备方法


[0001]本专利技术涉及间充质干细胞培养
，尤其涉及用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基及其制备方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞是一种源于中胚层的多能干细胞，广泛存在于骨髓、脐带、胎盘、脂肪等组织和血液中，能够无限制自我更新，多向分化，在合适的条件下，能在体外或者体内定向分化为脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞等等，作为组织修复的种子细胞，间充质干细胞可以在体内或者体外培养扩增，并能够分泌大量的细胞因子，具有免疫调节、炎症抑制等功能，用于治疗免疫相关疾病，而且间充质干细胞基本不具备免疫原性，能够异体移植，总的来说，间充质干细胞具有不菲的临床医用价值。
[0003]首先，传统方法中，干细胞的培养体系主要应用含动物血清的培养基，但是动物血清所带来的异源性污染和已知或未知的病毒、支原体等病原体污染，在此种环境下生长的干细胞，其内部结构会发生何种变化尚未可知，其次，市场上的无血清培养基存在价格昂贵、细胞生长周期短、细胞增殖效果不佳以及细胞衰老快等缺点。

技术实现思路

[0004]为了解决上述
技术介绍
中所提到的技术问题，而提出的用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基及其制备方法。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基，以DMEM/F12为基础培养基添加如下成分：10～22g/mL血清替代物、20～55ng/mL促生长因子、5～10ng/mL肌层细胞修复因子HCGF、5～16mM抗衰老因子、缓冲剂、0.5～3mg/L抗氧化剂、1～20mg/L维生素、抗生素、5～65mg/L微量元素、1～16μg/mL保护剂，所述缓冲剂与DMEM/F12基础培养基的体积比为1％，所述抗生素与DMEM/F12基础培养基的体积比为2％；
[0007]所述血清替代物包括10～20g/L人血白蛋白、5～20mg/L人转铁蛋白、1～10mg/L人胰岛素、1～5mg/L纤连蛋白和5～30μg/mL胆固醇；
[0008]所述促生长因子包括5～10ng/mL表皮生长因子EGF、5～10ng/mL成纤细胞生长因子FGF、5～10ng/mL血小板来源团增质因子PDGF、5～10ng/mL生长激素释放抑制因子SRIH、5～10ng/mL角化细胞生长因子KGF；
[0009]所述抗衰老因子包括5～10mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性酶SIRT1、1～3mM蛋白激酶B或者1～3mM 5
’‑
溴脱氧腺苷中的一种或者几种的混合物；
[0010]所述保护剂为1μg/mL乙醇胺和15μg/mL聚乙烯吡咯烷酮的混合物。
[0011]作为上述技术方案的进一步描述：
[0012]以DMEM/F12为基础培养基添加的成分还包括重组干扰素γ10～50μg/L、细胞松弛素D 0.5～2.0μg/mL和600～1000μg/mL无机盐，所述无机盐包括400～600μg/mL的钾盐、0.6
～0.9μg/mL的果糖二磷酸钠和200～300μg/mL的组胺二盐酸盐，所述钾盐为氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或者几种的混合物。
[0013]作为上述技术方案的进一步描述：
[0014]所述缓冲剂包括碳酸氢钠或者N
‑
取代的3
‑
氨基
‑2‑
羟基丙磺酸的衍生物中的一种。
[0015]作为上述技术方案的进一步描述：
[0016]所述抗氧化剂包括1mg/L葡萄籽、1.5mg/Lα
‑
硫辛酸或者0.5mg/L甘氨酸脱羟酶P蛋白抗体中的一种或者几种的混合物。
[0017]作为上述技术方案的进一步描述：
[0018]所述维生素包括1mg/L维生素A、5mg/L L
‑
抗坏血酸和10mg/L生育酚。
[0019]作为上述技术方案的进一步描述：
[0020]所述抗生素包括庆大霉素或者卡那霉素和两性霉素B或者曲古霉素的混合物。
[0021]作为上述技术方案的进一步描述：
[0022]所述微量元素包括20mg/L硫酸铜、15mg/L氯化镁、15mg/L硫酸锌和1μg/L亚硒酸钠。
[0023]作为上述技术方案的进一步描述：
[0024]所述人血白蛋白、人转铁蛋白、人胰岛素、纤连蛋白、表皮生长因子EGF、成纤细胞生长因子FGF、血小板来源团增质因子PDGF、生长激素释放抑制因子SRIH、角化细胞生长因子KGF和肌层细胞修复因子HCGF为重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、重组人纤连蛋白、重组人表皮生长因子EGF、重组人成纤细胞生长因子FGF、重组人血小板来源团增质因子PDGF、重组人生长激素释放抑制因子SRIH、重组人角化细胞生长因子KGF和重组人肌层细胞修复因子HCGF。
[0025]作为上述技术方案的进一步描述：
[0026]所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或者胎盘间充质干细胞。
[0027]作为上述技术方案的进一步描述：
[0028]用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0029]S1、将采用HBSS溶液清洗后的含有间充质干细胞的组织剪碎，向剪碎后的组织中加入含有Liberase酶的DMEM/F12基础培养基，混匀后于37℃震荡消化；
[0030]S2、对步骤S1处理后的消化产物进行低温离心，离心后抛弃上清，得到沉淀物；
[0031]S3、将步骤S2得到的沉淀物用所述培养基进行重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液置于培养皿中于37℃、饱和湿度、CO2体积分数为5％的培养箱内培养2～6h，然后采用HBSS溶液进行洗涤，洗去未贴壁的细胞，再向培养皿中加入权利要求1～8所述培养基进行培养；
[0032]S4、细胞在培养皿内长出，汇合度达到80％后，用胰酶或者胶原酶消化并收获细胞，以细胞密度8000个/cm2接种传代。
[0033]综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：
[0034]1、本专利技术中，间充质干细胞培养基成分确定，不含血清成分，质量可控，能够规模化生产，用其进行干细胞体外培养，干细胞能够正常生长，而且，本专利技术间充质干细胞培养基有利于干细胞的分裂增殖，极大地提高干细胞扩增速率，缩短干细胞的培养时间，同时，
采用本专利技术的培养基对干细胞进行多次传代次后，干细胞依然能够保持其原有的生物学特性和多向分化潜能。
[0035]2、本专利技术中，经过大量的研究筛选到了这些既快速扩增干细胞而又不影响其分化潜能的细胞生长因子，并对5种促生长因子进行配比，它们联合作用，能够促进干细胞分裂增殖，提高干细胞扩增速度，缩短干细胞培养时间，同时还能抑制干细胞分化但不影响干细胞的分化潜能，有利于干细胞的快速扩增，这些因子是天然存在的调节分子，能与细胞表面上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基，其特征在于，以DMEM/F12为基础培养基添加如下成分：10～22g/mL血清替代物、20～55ng/mL促生长因子、5～10ng/mL肌层细胞修复因子HCGF、5～16mM抗衰老因子、缓冲剂、0.5～3mg/L抗氧化剂、1～20mg/L维生素、抗生素、5～65mg/L微量元素、1～16μg/mL保护剂，所述缓冲剂与DMEM/F12基础培养基的体积比为1％，所述抗生素与DMEM/F12基础培养基的体积比为2％；所述血清替代物包括10～20g/L人血白蛋白、5～20mg/L人转铁蛋白、1～10mg/L人胰岛素、1～5mg/L纤连蛋白和5～30μg/mL胆固醇；所述促生长因子包括5～10ng/mL表皮生长因子EGF、5～10ng/mL成纤细胞生长因子FGF、5～10ng/mL血小板来源团增质因子PDGF、5～10ng/mL生长激素释放抑制因子SRIH、5～10ng/mL角化细胞生长因子KGF；所述抗衰老因子包括5～10mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性酶SIRT1、1～3mM蛋白激酶B或者1～3mM 5
’‑
溴脱氧腺苷中的一种或者几种的混合物；所述保护剂为1μg/mL乙醇胺和15μg/mL聚乙烯吡咯烷酮的混合物。2.根据权利要求1所述的用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基，其特征在于，以DMEM/F12为基础培养基添加的成分还包括重组干扰素γ10～50μg/L、细胞松弛素D 0.5～2.0μg/mL和600～1000μg/mL无机盐，所述无机盐包括400～600μg/mL的钾盐、0.6～0.9μg/mL的果糖二磷酸钠和200～300μg/mL的组胺二盐酸盐，所述钾盐为氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或者几种的混合物。3.根据权利要求1所述的用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基，其特征在于，所述缓冲剂包括碳酸氢钠或者N
‑
取代的3
‑
氨基
‑2‑
羟基丙磺酸的衍生物中的一种。4.根据权利要求1所述的用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基，其特征在于，所述抗氧化剂包括1mg/L葡萄籽、1.5mg/Lα
‑
硫辛酸或者0.5mg/L甘氨酸脱羟酶P蛋白抗体中的一种或者几种的混合物。...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈相波，雷鸣，田朋飞，应荣，
申请(专利权)人：杭州荣泽生物科技集团有限公司，
类型：发明
国别省市：