重组蛋白质水凝胶培养支架及其制备方法技术

一种基于重组蛋白质水凝胶的培养支架及其制备方法，通过构建融合精

【技术实现步骤摘要】
Reinforces Genetically Engineered Rubberlike Protein Hydrogels,Biomacromolecules 2021,22,961
–
970)。
[0011]所述的重组表达是指：将融合RGD序列的类节肢蚕丝重组蛋白表达载体pET
‑
19b3
‑
RGD
‑
R4S8
‑
5转入到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)(购自天根生化科技有限公司)，对重组菌进行培养，并用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合RGD序列的类节肢蚕丝蛋白的表达。
[0012]所述的分离纯化是指：利用镍离子金属鳌合(Ni
‑
NTA)亲和层析柱对表达得到的融合RGD序列的类节肢蚕丝蛋白分离纯化。
[0013]所述的温度刺激是指：将纯化后的不同浓度的融合RGD序列的类节肢蚕丝蛋白放置在37℃的条件下孵育30分钟。
[0014]所述的循环处理是指：向温度刺激后的5％(w/v)的融合RGD序列的类节肢蚕丝蛋白溶液中加入0.2％(w/v)海藻酸钠溶液、辣根过氧化物酶及过氧化氢，充分混匀后，在37℃条件下反应10分钟后，将其置于25mM的氯化钙溶液中浸泡30分钟即可得到初始水凝胶，将此初始水凝胶浸泡于α
‑
MEM培养基中12小时后，将其分别浸泡于25mM、125mM和250mM的柠檬酸钠溶液中30分钟，然后将其浸泡于α
‑
MEM培养基中12小时，之后依次循环上述氯化钙、培养基以及柠檬酸钠的浸泡体系后得到。
[0015]所述的辣根过氧化物酶的酶活为600U/mL，过氧化氢的浓度为0.03％(w/v)。
[0016]本专利技术涉及上述方法制备得到的动态纤维网水凝胶，其具有类天然胞外基质的纤维形貌且压缩模量在2
‑
22kPa循环调控。
[0017]所述的循环调控，具体是：每24小时内，一次30分钟氯化钙浸泡后，进行11.5小时培养基浸泡，然后一次30分钟柠檬酸钠浸泡，再次进行11.5小时培养基浸泡。
[0018]本专利技术涉及上述动态纤维网水凝胶的应用，将其用于间充质干细胞的三维培养，具体为：将消化悬浮的BMSCs滴加到制备动态纤维网水凝胶支架的混合液中，待其形成水凝胶后，循环更换海藻酸钠、氯化钙和培养基的浸泡体系，即可用于BMSCs的三维培养。技术效果
[0019]本专利技术借助重组蛋白的成纤维自组装行为以及氯化钙与柠檬酸钠的络合反应，实现细胞培养基质的力学性能、纤维形貌与内部空间的协同动态调控，有效促进间充质干细胞在三维培养中的增殖与延展。
附图说明
[0020]图1为RGD
‑
(R4S8)5的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图；
[0021]图中：箭头所指位置即为目标蛋白分子量；
[0022]图2为RGD
‑
(R4S8)5溶液在37℃孵育30分钟后，通过原子力显微镜拍摄得到的形貌图。
[0023]图3至图10为实施例效果图；
[0024]图3为5％(w/v)的RGD
‑
(R4S8)5溶液在37℃孵育30分钟后，与0.2％(w/v)的海藻酸钠溶液充分混合，经酶催化交联及氯化钙溶液浸泡形成初始水凝胶后，经过一次不同浓度柠檬酸钠溶液浸泡后的压缩模量。
[0025]图4为5％(w/v)的RGD
‑
(R4S8)5溶液在37℃孵育30分钟后，与0.2％(w/v)的海藻酸钠溶液充分混合，经酶催化交联及氯化钙溶液浸泡形成初始水凝胶后，经不同浓度柠檬酸
钠溶液和一定浓度的氯化钙溶液多次循环浸泡后的水凝胶的压缩模量。
[0026]图5为5％(w/v)的RGD
‑
(R4S8)5溶液在37℃孵育30分钟后，与0.2％(w/v)的海藻酸钠溶液充分混合，经酶催化交联及氯化钙溶液浸泡形成初始水凝胶后，经不同浓度柠檬酸钠溶液浸泡后的水凝胶的电子扫描显微镜形貌图。
[0027]图6为5％(w/v)的RGD
‑
(R4S8)5溶液在37℃孵育30分钟后，与0.2％(w/v)的海藻酸钠溶液充分混合，经酶催化交联及氯化钙溶液浸泡形成初始水凝胶后，经不同浓度柠檬酸钠和一定浓度氯化钙溶液循环十次浸泡后水凝胶的电子扫描显微镜形貌图。
[0028]图7为5％(w/v)的RGD
‑
(R4S8)5溶液在37℃孵育30分钟后，与0.2％(w/v)的海藻酸钠溶液和BMSCs悬液充分混合，经酶催化交联及氯化钙溶液浸泡形成包裹BMSCs的初始水凝胶后，经不同浓度柠檬酸铵溶液和一定浓度氯化钙溶液循环浸泡，培养三天后的BMSCs活死染图像。
[0029]图8为5％(w/v)的RGD
‑
(R4S8)5溶液在37℃孵育30分钟后，与0.2％(w/v)的海藻酸钠溶液和BMSCs悬液充分混合，经酶催化交联及氯化钙溶液浸泡形成包裹BMSCs的初始水凝胶后，经不同浓度柠檬酸钠溶液和一定浓度的氯化钙溶液循环浸泡，培养1、3、5、7天后的BMSCs的增殖活力。
[0030]图9为5％(w/v)的RGD
‑
(R4S8)5溶液在37℃孵育30分钟后，与0.2％(w/v)的海藻酸钠溶液和BMSCs悬液充分混合，经酶催化交联及氯化钙溶液浸泡形成包裹BMSCs的初始水凝胶后，经不同浓度柠檬酸钠溶液和一定浓度的氯化钙溶液循环浸泡，培养三天后的BMSCs的形貌。
[0031]图10为5％(w/v)的RGD
‑
(R4S8)5溶液在37℃孵育30分钟后，与0.2％(w/v)的海藻酸钠溶液和BMSCs悬液充分混合，经酶催化交联及氯化钙溶液浸泡形成包裹BMSCs的初始水凝胶后，经不同浓度海藻酸钠柠檬酸钠溶液和一定浓度的氯化钙溶液循环浸泡，诱导分化七天后CD31的免疫荧光图。
具体实施方式
实施例1
[0032]本实施例是进行载体的构建，具体过程如下：本实施例通过构建融合蛋白的表达载体，并将该表达载体导入大肠杆菌中实现表达生产，以下为具体操作过程：通过点突变试剂盒，将编码RGD多肽的基因片段，即5
’‑
CGTGGTGATATCGACGACGACGACAAG
‑3’
与5
’‑
ATGGCCGCTGCTGTGATGATG
‑3’
导入编码类节肢蚕丝蛋白的质粒中，以构建融合RGD序列的类节肢蚕丝蛋白的表达载体pET
‑
19b3
‑
RGD
‑
R4S8
‑
5。然后将该表达载体转入到表达宿主细胞中，将该细胞在含氨苄青霉素(0.1mg/mL)的4mL LB培养基中37℃培养至OD600达到1.8～2.0时，以1％的接种量转入含氨苄青霉素的100mL的LB培养基中37℃培养至OD600达到3.0～4.0，将其全部转入到含氨苄青霉素的8本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于重组蛋白质水凝胶的培养支架制备方法，其特征在于，通过构建融合精
‑
甘
‑
天冬三肽序列的类节肢蚕丝重组蛋白表达载体，并将其导入表达宿主细胞中，经重组表达、分离纯化和温度刺激处理后，通过与海藻酸钠混合并经酶催化交联以及氯化钙和柠檬酸钠循环处理，得到动态纤维网水凝胶。2.根据权利要求1所述的基于重组蛋白质水凝胶的培养支架制备方法，其特征是，所述的构建是指：利用反向PCR定点突变试剂盒将表达Arg
‑
Gly
‑
ASP(RGD)序列的基因整合到类节肢蚕丝重组蛋白(R4S8)5的表达载体pET
‑
19b3
‑
R4S8
‑
5，以构建融合RGD序列的类节肢蚕丝重组蛋白(R4S8)5的表达载体pET
‑
19b3
‑
RGD
‑
R4S8
‑
5。3.根据权利要求2所述的基于重组蛋白质水凝胶的培养支架制备方法，其特征是，所述的类节肢蚕丝重组蛋白是由类节肢弹性蛋白嵌段(R)和类蚕丝蛋白嵌段(S)所构成的融合蛋白，其氨基酸序列为[(GGRPSDSYGAPGGGN)4‑
(GAGAGS)8]5；所述的反向PCR定点突变所采用的正向引物RGD
‑
F如Seq ID No.1所示，具体为：5
’‑
CGTGGTGATATCGACGACGACGACAAG
‑3’
，反向引物RGD
‑
R如Seq ID No.2所示，具体为：5
’‑
ATGGCCGCTGCTGTGATGATG
‑3’
。4.根据权利要求1所述的基于重组蛋白质水凝胶的培养支架制备方法，其特征是，所述的重组表达是指：将融合RGD序列的类节肢蚕丝重组蛋白表达载体pET
‑
19b3
‑
RGD
‑
R4S8
‑
5转入到...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏小霞，田凯凯，黄盛晨，钱志刚，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：