一种干细胞衍生品及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种干细胞衍生品及其制备方法和应用。其制备方法包括如下步骤：步骤S1:在3～10％氧浓度的环境下，将脐带或胎盘制备成组织块，将所述组织块在第一培养基中进行培养，当贴壁细胞的融合度为30％～90％时，进行细胞消化传代，将消化传代后的细胞传到第4至6代时，将细胞继续接种于第二培养基中继续培养48～72h后，离心得到第一上清液和沉淀。步骤S2：将沉淀用生理盐水重悬，将细胞破碎离心得到第二上清液；步骤S3：将第一上清液和第二上清液合在一起经过除菌过滤，再超滤得到干细胞衍生品。本发明专利技术的方法能够获得大量的干细胞衍生品。生品。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞衍生品及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种干细胞衍生品及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]干细胞衍生品是由各种来源的间充质干细胞或其他组织干细胞(如神经干细胞，皮肤干细胞等)经体外扩增培养获得的细胞因子和外泌体等具有高活性的物质(成分包括：角质细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、白细胞介素
‑
6、粒细胞集落刺激因子、转化生长因子
‑
β、血小板衍生因子、促红细胞生成素、基质细胞衍生因子、多种活性肽、酶、透明质酸和蛋白质、核酸、脂质等)。
[0003]干细胞具有强大的旁分泌功能，其分泌物富含多种生长因子和信号分子，可激活其临近细胞或组织，从而产生相应的生物学作用。干细胞衍生品的作用也基于此。随着不断的临床摸索，拥有各种生物学功效的干细胞衍生品的应用价值，从被认识逐渐到被认可。目前干细胞衍生品在烧伤烫伤，难愈合性溃疡及术后创伤修复领域的潜在应用价值比较大。目前，对于干细胞衍生品的制备大多是超速离心或蛋白质沉淀法，存在制备时间长，收获量少等缺点。
[0004]因此，有必要开发一种高效且大量制备干细胞衍生品的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本专利技术提供了一种干细胞衍生品的制备方法。
[0006]本专利技术还提供了一种干细胞衍生品。
[0007]本专利技术还提供了一种干细胞衍生品的应用。
[0008]本专利技术的第一方面提供了一种干细胞衍生品的制备方法，包括如下步骤：
[0009]步骤S1:在3～10％氧浓度的气氛下，将脐带或胎盘制备成组织块，将所述组织块在第一培养基中进行培养，当贴壁细胞的融合度为30％～90％时，进行细胞消化传代，将消化传代后的细胞传到第4至6代时，将细胞继续接种于第二培养基中继续培养48～72h后，以6000～8000g，2～6℃离心10～30min得到第一上清液和沉淀；
[0010]步骤S2：将步骤S1所得的沉淀用生理盐水重悬，将细胞反复冻融或超声波破碎后，8000～10000g，2～6℃离心10～30min，得到第二上清液；
[0011]步骤S3：将第一上清液和第二上清液合并得到混合液，将所述混合液经过除菌过滤后进行第一次超滤得到第一滤液，将所述第一滤液进行第二次超滤，得到第二滤液，所述第二滤液即为干细胞衍生品，所述超滤采用的超滤膜为300～500KD。
[0012]本专利技术关于干细胞衍生品的制备方法的技术方案中的一个技术方案，至少具有以下有益效果：
[0013]本专利技术首先以3～10％的低氧浓度下对间充质干细胞进行培养，促进细胞外泌体和细胞因子的分泌，再通过破碎细胞、过滤除菌和超滤离心从而能够获得大量的干细胞衍
生品。
[0014]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S3中，所述混合液还包括检测步骤：对所述混合液进行厌氧菌、需氧菌、内毒素和支原体检测。
[0015]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S2中，所述超声波破碎至少包括以下条件：超声时间为1～5秒、间隙时间为5～10秒、超声10～30次、超声温度为2～6℃。
[0016]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S2中，细胞反复冻融包括以下步骤：所述反复冻融是指先冷至
‑
20℃以下；再加热至30～40℃，交替进行若干次。
[0017]根据本专利技术的一些实施方式，步骤S3中，第一次超滤的条件是；经过500KD超滤膜的超滤管中4000～8000g，2～6℃，10～30min离心细胞碎片和大分子量蛋白分子；第二次超滤的条件是：再将离心管内的液体在300KD超滤膜的超滤管进行4000～8000g，2～6℃，10～30min离心得到干细胞衍生品。
[0018]根据本专利技术的一些实施方式，在所述步骤S3中还设有检测程序：对上清液进行厌氧菌、需氧菌、内毒素和支原体检测。
[0019]根据本专利技术的一些实施方式，所述方法还包括在步骤S3后，将所述干细胞衍生品在4～
‑
80℃条件下进行保存或制备成冻干粉、凝胶剂进行保存。
[0020]将所述干细胞衍生品进行4℃条件下保存一周，
‑
80℃下保存6个月；制备成冻干粉，或凝胶剂冷藏的方式保存2年。
[0021]根据本专利技术的一些实施方式，所述第一培养基是含有5～10％血清的培养基。所述第一培养基可以是市购基础培养基，也可以选自DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培养基、a
‑
MEM(minimum Eagle's medium)培养基、MEM
‑
EBSS(MEM Eagles withEarle
’
sBalanced Salts)培养基中的至少一种。
[0022]根据本专利技术的一些实施方式，所述第二培养基为不含外源外泌体的培养基和无血小板裂解物添加物的培养基。
[0023]根据本专利技术的一些实施方式，所述第二培养基可以是市购基础培养基，也可以是选自DMDM培养基、a
‑
MEM培养基、MEM
‑
EBSS培养基中的至少一种。
[0024]本专利技术的第二方面提供一种干细胞衍生品，由上述制备方法制备得到。
[0025]本专利技术的第三方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括活性成分和药学上可接受的辅料，所述活性成分包括所述的干细胞衍生品；或由上述所述的制备方法制备的干细胞衍生品。
[0026]所述药学上可接受的辅料包括但并不限于，离子交换剂；铝；硬脂酸铝；卵磷脂；血清蛋白，如人血清蛋白；缓冲物质如磷酸盐；甘氨酸；山梨酸；山梨酸钾；饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物；水；盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐；胶体硅；三硅酸镁；聚乙烯吡咯烷酮；聚丙烯酸脂；蜡；聚乙烯
‑
聚氧丙烯
‑
阻断聚合体；羊毛脂；糖，如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素和它的衍生物如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和乙酸纤维素；树胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；辅料如可可豆脂和栓剂蜡状物；油如花生油，棉子油，红花油，麻油，橄榄油，玉米油和豆油；二醇类化合物，如丙二醇和聚乙二醇；酯类如乙基油酸酯和乙基月桂酸酯；琼脂；缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐；林格(氏)溶液；乙醇；磷酸缓冲溶液；和其他无毒的合适的润滑剂如月桂硫酸钠和硬脂酸镁；着色剂；释放剂；包衣衣料；甜味剂；调味剂；香料；防腐剂
和抗氧化剂。
具体实施方式
[0027]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0028]本专利技术所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本
常规试剂、方法和设备。
[0029]以下实施例及对比例中采用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干细胞衍生品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1:在3～10％氧浓度的气氛下，将脐带或胎盘制备成组织块，将所述组织块在第一培养基中进行培养，当贴壁细胞的融合度为30％～90％时，进行细胞消化传代，将消化传代后的细胞传到第4至6代时，将细胞继续接种于第二培养基中继续培养48～72h后，以6000～8000g，2～6℃，10～30min离心得到第一上清液和沉淀；步骤S2：将步骤S1所得的沉淀用生理盐水重悬，将细胞反复冻融或超声波破碎后，8000～10000g，2～6℃离心10～30min，得到第二上清液；步骤S3：将第一上清液和第二上清液合并得到混合液，将所述混合液经过除菌过滤后进行第一次超滤得到第一滤液，将所述第一滤液进行第二次超滤，得到第二滤液，所述第二滤液即为干细胞衍生品，所述超滤采用的超滤膜为300～500KD。2.根据权利要求1所述的干细胞衍生品的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述混合液还包括检测步骤：对所述混合液进行厌氧菌、需氧菌、内毒素和支原体检测。3.根据权利要求1所述的干细胞衍生品的制备方法，其特征在于，所述超声波破碎至少包括以下条件：超声时间为1～5秒、间隙时间为5～10秒、超声10～30次、超声温度为2～6℃。4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦红，游昌乔，李灿，丁浩，陈艳，
申请(专利权)人：湖南南华爱世普林生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：