一种干细胞提取物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种干细胞提取物的制备方法及其应用。本发明专利技术基于干细胞的修复和再生能力，提供一种干细胞提取物的制备工艺，制备方法简单，使用便捷，在治疗脱发和糖尿病创面具有极大的应用潜力。发和糖尿病创面具有极大的应用潜力。发和糖尿病创面具有极大的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞提取物的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种干细胞提取物的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]干细胞具有自我更新和分化的特性，是组织工程的万能种子细胞，可分泌多种生长因子（HGF、VEGF、IGF、PDGF）促进组织再生和修复。同时由于干细胞的低免疫原性，在进行同种异体移植时生物相容性极好，在治疗脱发和糖尿病创面方面都有大量的临床应用。
[0003]脱发患者包括雄激素脱发、油脂性脱发和病理性脱发。雄激素脱发（AGA）是最常见的脱发类型，在50岁以上人群中，50%男性和45%女性都会发生不同程度的AGA。虽然脱发并不危及人的生命安全，但是会影响人的外貌和自尊，造成极大的心理负担。目前经国内外药监局批准治疗AGA的药物主要是甾体类5α-还原酶抑制剂，代表药物为非那雄胺、度他雄胺和依立雄胺，此类药物可以有效地控制男性型秃发患者头发的继续脱落，但是会引起不良反应包括性欲减退、勃起功能障碍、射精量减少、射精障碍、皮疹、乳房增大或压痛等。2019年英国进行的一项干细胞治疗脱发项目中，将毛囊干细胞与盐水混合并注入头皮，结果显示休眠毛囊细胞被触发进入新生长阶段，显著增加头发密度。
[0004]中国的糖尿病患者有1.4亿人，糖尿病患者容易发生皮肤溃疡，15-25%的患者会发展成糖尿病足。糖尿病创面属于慢性创面，可能存在多种病原微生物、炎症介质等构成不利于干细胞修复的微环境，同时糖尿病患者以中老年为主，体内的干细胞数量和活性都出现下降，以致组织修复能力下降。目前国内外有大量临床数据，证实通过在溃疡四周采取点阵注射或者静脉回输的方式，都可以促进病变和坏死的皮肤、血管、神经等组织进行再生修复，促进伤口愈合。
[0005]但是在以往的临床研究中，都是通过微针或注射的方式将活的干细胞移植到体内，易造成局部感染，且干细胞存活率低，要达到良好的疗效需要重复注射多次，给患者带来不便和痛苦。
[0006]因此，本领域亟待开发新型的干细胞提取物和应用方法，以推进干细胞技术的临床应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种干细胞提取物制备方法及其应用，能够有效治疗脱发和糖尿病创面。
[0008]本专利技术的技术方案是这样实现的：1.分离间充质干细胞。使用组织块培养、酶消化培养，从人来源的脐带、胎盘、脂肪、骨髓、牙髓、外周血、脐带血、尿液、宫内膜、经血中分离得到间充质干细胞，加入10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，细胞接种密度为1-5
×
105cells/cm2，三天后清洗掉未贴壁细胞，当间充质干细胞融合度达到80-90%，加入0.05%的胰酶消化，按1:3比例进行传代培养。
[0009]2.鉴定间充质干细胞。通过流式鉴定其表面干细胞标记物CD44，CD29，CD105呈阳
性，内皮细胞标记物CD31，CD45呈阴性。
[0010]2.在收集干细胞前2天更换培养基为无血清培养，收集P2-P5代干细胞10e7-10e8，使用1-10 mLPBS重悬细胞，对收获的干细胞进行流式检测。
[0011]3获得干细胞提取物。使用组织匀浆或者超声破碎技术将干细胞进行细胞破碎，显微镜下观察破碎情况。
[0012]4.浓缩和过滤干细胞提取物。将破碎后的干细胞经超速离心机进行离心，转速在800-150000g，使用生理盐水重悬沉淀物，并进行除菌过滤。
[0013]5.制备干细胞提取物终产品。将无菌处理后的干细胞提取物，按体积比例（v/v）0.5-10%加入无菌的水、生理盐水、PBS、葡萄糖溶液等溶液中的1种或多种制备成液体制剂，或者加入水凝胶（胶原、海藻酸盐、壳聚糖、玻尿酸）制成凝胶敷料。
[0014]6.干细胞提取物终产品的临床应用。将干细胞提取物终产品涂抹或喷洒在脱发或糖尿病创面部位，每日1-4次，持续使用4-48周。
[0015]本专利技术的优点在于：1）干细胞提取物制备工艺简便易行，易于放大和规模化生产。
[0016]2）相较于活的干细胞，干细胞提取物更易无菌处理，储存、运输更加方便。
[0017]3）避免有创操作，使用便捷，适合个人家庭使用。
[0018]附图说明
[0019]下面对间充质干细胞提取物的制备和应用进行说明。
[0020]图1是本专利技术所述的间充质干细胞流式细胞检测结果。表面干细胞标记物CD45，CD69，CD105呈阳性，内皮细胞标记物CD31，CD45呈阴性。
[0021]图2 是使用干细胞提取物喷雾治疗前后脱发患者的头发增量照片。
[0022]图3是使用干细胞提取物凝胶治疗前后糖尿病足患者的创口部位照片。
具体实施方式
[0023]本专利技术结合附图和实施例进行进一步的说明。
[0024]实施例1 一种干细胞提取物制备方法，包括以下步骤：1.实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。
[0025]2.脐带间充质干细胞的分离和鉴定1）在健康产妇知情情况下获得脐带30 cm，在手术室采集后即使用无菌PBS浸泡并运送到实验室，75%酒精浸泡1分钟并冲洗后放在10 cm平皿中，无菌PBS冲洗3次。
[0026]2）将脐带剪成5 cm小段，用镊子撕开脐带并小心去除血管（包括2根动脉、1根静脉），小心将脐带撕成细丝。
[0027]3）将细丝转移到50 mL离心管中，加入10mLPBS混匀后，将手术剪插入离心管进行快速剪碎。
[0028]4）将剪碎的组织块接种在10cm直径的培养皿中，放置在培养箱进行培养。等待组织块附着部分有细胞爬出贴壁生长时，洗去组织块，更换培养基，继续培养72小时。
[0029]5）取出培养皿观察，继续培养到细胞融合度80%，加入胰酶消化并传代。
[0030]6）使用流式细胞仪检测间充质干细胞的表面干细胞标记物CD44，CD29，CD105的表达。
[0031]3.间充质干细胞的制备在收集干细胞前2天更换培养基为无血清培养，收集P2-P5代干细胞10e7-10e8，使用1-10 mLPBS重悬细胞。
[0032]4. 获得干细胞提取物使用超声破碎技术将干细胞进行细胞破碎，显微镜下观察破碎情况。
[0033]5.浓缩和过滤干细胞提取物将破碎后的干细胞经超速离心机进行离心，转速50000g，使用生理盐水重悬沉淀物，并经0.22微米滤膜进行除菌过滤。
[0034]6.干细胞提取物终产品将无菌处理后的干细胞提取物，按提取物浓度1%（v/v）比例加入无菌的生理盐水，并装入真空喷雾瓶中。
[0035]实施例2 一种干细胞提取物制备方法，包括以下步骤：1.实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。
[0036]2. 胎盘间充质干细胞的分离和鉴定1）在健康产妇知情情况下获得胎盘，在手术室采集后即使用无菌PBS浸泡并运送到实验室，75%酒精浸泡1分钟并冲洗后，无菌PBS冲洗3次。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干细胞提取物制备方法及其应用，其特征在于，实现此发明主要包括以下步骤：（1）分离和鉴定间充质干细胞；（2）在培养瓶（皿）或生物反应器中，培养间充质干细胞；（3）使用机械方法破碎间充质干细胞，收获干细胞提取物；（4）制备含有干细胞提取物的终产品；（5）干细胞提取物终产品的临床应用。2.根据权利要求1所述的干细胞提取物制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞包括脐带、胎盘、脂肪、骨髓、牙髓、外周血、脐带血、尿液、宫内膜、经血来源的间充质干细胞。3.根据权利要求1所述的干细胞提取物制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞分离方法包括组织块培养和酶消化培养。4.根据权利要求1所述的干细胞提取物制备方法，其特征在于，所述细胞破...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈传果，
申请(专利权)人：陈传果，
类型：发明
国别省市：