一种脐带间充质干细胞的分离方法技术

本发明专利技术公开了一种脐带间充质干细胞的分离方法，其包括以下步骤：处理脐带，获得华通氏胶；将华通氏胶处理成泥状，加入质量浓度为3％的Ⅱ型胶原酶、质量浓度为3％的透明质酸酶和2mmol/L氯化钙溶液混匀，消化处理40min，用含15％血清及1％双抗的α

【技术实现步骤摘要】
一种脐带间充质干细胞的分离方法


[0001]本专利技术涉及干细胞
，具体涉及一种脐带间充质干细胞的分离方法。

技术介绍

[0002]目前临床间充质干细胞主要来源于骨髓、脐带。与骨髓来源的间充质干细胞相比，人脐带组织作为“医疗废物”，脐带间充质干细胞(UC
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MSCs)以更加易于获得，对母子均无损伤，且细胞含量高、增殖能力强、扩增迅速、免疫原性低，冻存和复苏后细胞的生物学性状无明显变化，越来越受到研究者的关注，使其成为细胞治疗中的理想种子细胞。然而，相关技术中脐带间充质干细胞的分离存在步骤繁琐，耗时长，且通过胰酶处理后细胞活性降低、从脐带中释放的细胞总量欠佳等问题。

技术实现思路

[0003]为了解决上述问题，本专利技术提出一种脐带间充质干细胞的分离方法，该方法可在提高细胞的分离效率的同时，保证细胞的活性。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术的实施例提出了一种脐带间充质干细胞的分离方法，其包括以下步骤：
[0005]处理脐带，获得华通氏胶；
[0006]将华通氏胶处理成泥状，加入质量浓度为3％的Ⅱ型胶原酶、质量浓度为3％的透明质酸酶和2mmol/L氯化钙溶液混匀，消化处理40min，用含15％血清及1％双抗的α
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MEM培养基终止消化，过筛，收集滤液，滤液离心，得细胞沉淀。
[0007]根据本专利技术实施例的一种脐带间充质干细胞的分离方法，通过Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶和氯化钙溶液的组合消化脐带，可高效地酶解脐带华通胶组织，并维持细胞的活性；酶解时间得到有效缩短；并且获得的脐带间充质干细胞可稳定传代。
[0008]另外，根据本专利技术上述实施例提出的一种脐带间充质干细胞的分离方法，还可以具有如下附加的技术特征：
[0009]可选地，终止消化后，100μm细胞筛滤除未完全消化组织，收集滤液，300g离心5min，得细胞沉淀。
[0010]可选地，处理脐带时，用无菌剪刀去除脐带头尾两端，并剪取2cm脐带，用无菌解剖镊沿脐带扭曲纹路撕开，剥离静脉和动脉，获得华通氏胶。
[0011]可选地，消化处理时，在37℃恒温摇床中进行。
[0012]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0013]图1为根据本专利技术实施例1的细胞流式分析；
[0014]图2为根据本专利技术实施例1的细胞培养后电镜图；
[0015]图3为根据本专利技术对比例1的细胞流式分析；
[0016]图4为根据本专利技术对比例2的细胞流式分析；
[0017]图5为根据本专利技术对比例3的细胞流式分析；
[0018]图6为根据本专利技术对比例4的细胞流式分析；
[0019]图7为根据本专利技术对比例5的细胞流式分析；
[0020]图8为根据本专利技术对比例6的细胞流式分析。
具体实施方式
[0021]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的技术方案。应理解，本专利技术提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本专利技术可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更
技术实现思路
的情况下，当亦视为本专利技术可实施的范畴。
[0022]为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本专利技术的示例性实施例。虽然显示了本专利技术的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0023]本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0024]下面参考具体实施例，对本专利技术进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本专利技术。
[0025]实施例1
[0026]脐带分离处理：
[0027]1)无菌止血钳夹取脐带，将其从保存液中取出置于生物安全柜，测量长度并拍照记录；
[0028]2)无菌组织剪刀去除脐带头尾两端，并剪取2cm左右脐带待剖；
[0029]3)无菌解剖镊沿脐带扭曲纹路撕开，剥离静动脉，获取华通氏胶(Wharton
’
s Jelly)。
[0030]华通氏胶消化处理：
[0031]用眼科剪将2cm的华通氏胶剪成泥状，再加入灭菌后的10mL浓度为3％的Ⅱ型胶原酶、浓度为3％的透明质酸酶和浓度为2mmol/L的氯化钙溶液混匀，于37℃恒温摇床中消化40min。
[0032]消化完成后，用含15％血清及1％双抗的α
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MEM培养基(购买于HyClone)终止消化，随后通过100μm细胞筛滤除未完全消化组织，收集滤液，300g离心5min，得到消化后的细胞。
[0033]经过细胞板计数法对细胞计数可知，本实施例获得的细胞量约为4.8
×
105；对得到的细胞进行DAPI染色后进行细胞流式分析，具体为将上述细胞悬液通过300g 5min 4℃
[0034]去除细胞上清，加入150μL PBS混匀后加入1μL的DAPI染色，随后进行细胞流式分析，结果如图1所示，本实施例得到的活细胞比率为93.1％。
[0035]将上述离心管中的上清去除，用含15％血清及1％双抗的α
‑
MEM培养重悬细胞后置
于37℃、5％CO2恒温培养箱进行扩增培养。细胞生长状态良好，P9以后随着传代次数的增加，形态变大，增值速度减慢，可传到15代(见图2)。
[0036]对比例1
[0037]本对比例与实施例1提供的方法大致相同，区别在于消化液不同，具体为：
[0038]用眼科剪将2cm的华通氏胶剪成泥状，再加入灭菌后的10mL浓度为3％的Ⅱ型胶原酶、浓度为3％的I型胶原酶、浓度为3％的透明质酸酶和浓度为2mmol/L的氯化钙溶液混匀，于37℃恒温摇床中消化40min。
[0039]消化完成后，用含15％血清及1％双抗的α
‑
MEM培养基终止消化，随后通过100μm细胞筛滤除未完全消化组织，收集滤液，300g离心5min，得到消化后的细胞。
[0040]经过细胞计数可知，本对比例获得的细胞量约为5.1
×
105；对得到的细胞进行DAPI染色后进行细胞流式分析，结果如图3所示，本对比例得到的活细胞比率为81.3％。
[0041]对比例2
[0042]本对比例与实施例1提供的方法大致相同，区别在于消化液不同，具体为：
[0043]用眼科剪将2cm的华通氏胶剪成泥状，再加入灭菌后的10mL浓度为3％的Ⅱ型胶原酶、浓度为3％的胰酶和浓度为2mmol本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：处理脐带，获得华通氏胶；将华通氏胶处理成泥状，加入质量浓度为3％的Ⅱ型胶原酶、质量浓度为3％的透明质酸酶和2mmol/L氯化钙溶液混匀，消化处理40min，用含15％血清及1％双抗的α
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MEM培养基终止消化，过筛，收集滤液，滤液离心，得细胞沉淀。2.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：许韧，吕红斌，许琰，李娜，胡建中，
申请(专利权)人：厦门骨本生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：