促进顽固性压疮愈合的脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种促进顽固性压疮愈合的脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法，为解决顽固性压疮缺少促进愈合的药物，是脐带间充质干细胞用含血清的DMEM培养基进行传代过程中的终止消化和用DMEM基培养液培养及传代培养而得，培养液由DMEM培养基85

【技术实现步骤摘要】
促进顽固性压疮愈合的脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种脐带间充质干细胞外泌体，特别是涉及一种促进顽固性压疮愈合的脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法。

技术介绍

[0002]现有一种miRNA145
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5p修饰脐带间充质干细胞分泌的外泌体及其制备与应用专利技术专利现有技术，是通过以下方法制备：(1)采用新鲜脐带培养人脐带间质干细胞；(2)制备高表达miRNA145
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5p的间充质干细胞；(3)条件培养基的储备；(4)外泌体的抽提与纯化。本专利技术所述的高表达microRNA145
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5p的人脐带间充质干细胞来源的外泌体作为生物制剂转入大鼠背部全层创面模型中可有效促进皮肤肉芽组织增生，加快创口愈合速度并能拮抗瘢痕挛缩。本专利技术为创面治疗提供了新手段和方法。其为临床解决皮肤尤其是全层大面积缺损燕拮抗瘢痕挛缩开启以修饰过后的外泌体为活性成份的新疗法，但是，没见用于促进压疮愈合。
[0003]褥疮(decubitus)又名压疮(pressure sores)，系身体局部长期受压使血液循环受阻，而引起的皮肤及皮下组织缺血而发生水疱、溃疡或坏疽。 本病与祖国医学文献中记载的“席疮”相似。如。外科真诠〃席疮记载：“席疮乃久病着床之人，挨擦磨破而成，上而背脊，下而尾闾。
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以上原因所致的长期压迫且集中于身体某一部位，足以使局部血循环受阻而导致组织缺氧，从而引起组织损伤和坏死。若继续受压会导致全层皮肤坏死缺损。产生的溃疡易导致细菌感染。由于溃疡基部及边缘的毛细血管和静脉淤血，加之逐渐形成大量肉芽组织，使溃疡或坏疽区在皮下迅速穿凿扩大，于数天内可使其直径达3～6cm，穿凿范围可距边缘8～10cm，向深部发展可累及骨膜甚至骨质，引起局灶性骨膜炎或骨髓炎。系身体局部长期受压使血液循环受阻，而引起的皮肤及皮下组织缺血而发生水疱、溃疡或坏疽。一般来说，长期卧床、体质衰弱、翻身不便及肢体感觉迟钝者易患褥疮，临床上多见于以下三类患者1.昏迷及瘫痪病人。2.卧床不起，体质衰弱的病人。3.骨折后长期固定或卧床的病人。压疮因患病原因特殊，是传统的顽固难愈性疾病，缺少促进愈合的药物是难愈的主要原因。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种促进顽固性压疮愈合的脐带间充质干细胞外泌体，本专利技术还提供该外泌体的制备方法。
[0005] 为实现上述目的，本专利技术促进顽固性压疮愈合的脐带间充质干细胞外泌体，其特别之处在于是脐带间充质干细胞用含血清的DMEM培养基进行传代过程中的终止消化和用DMEM基培养液培养及传代培养而得，培养液由DMEM培养基85
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95ml和Pall Uleroser G 血清代替物1.5
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2.5ml、中药扛板归黄芪提取液3
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5ml、含燕窝酸300
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500mg的燕窝酸溶液2ml和含有乳铁蛋白0.4
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0.6mg的重组人乳铁蛋白2ml配制而成。经临床应用证明，具有能促进传统顽固难愈性疾病压疮愈合，并且疗效明显优于现有常用药的优点。
[0006]作为优化，培养液由DMEM培养基90ml和Pall Uleroser G 血清代替物2ml、中药扛板归黄芪提取液4ml、含燕窝酸400mg的燕窝酸溶液2ml和含有乳铁蛋白0.5mg的重组人乳铁蛋白2ml配制而成。
[0007]作为优化，中药扛板归黄芪提取液是扛板归、黄芪各取等量加4倍水煮两次，收集药液经过滤浓缩、消毒，每100ml扛板归黄芪提取液由黄芪10g、扛板归10g提取而得。
[0008]作为优化，所述Pall Uleroser G 血清代替物含生长因子，粘附因子，荷尔蒙，结合蛋白，维生素，微量矿物元素。
[0009]作为优化，所述培养是取自正常、足月产新生儿脐带，进行消毒、清洗；置于含青链霉素的高糖DMEM培养基中进行后续处理；将脐带用生理盐水洗去脐带残留血液，剪成小段，多次漂洗，纵行剖开脐带，剔除动静脉血管，剪成小块组织，将组织块置于EP管中，用手术剪将组织块剪成约小块，均匀放置到培养皿中；将贴有组织块的培养皿置于培养箱；待组织块呈半透明状态时，加入培养液，置于培养箱中继续培养。
[0010]换液：每2
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3天将培养皿中的培养液抽出弃掉，PBS洗三遍，加入新的培养液，置于培养箱中继续培养，取得F0代细胞。
[0011]细胞传代培养：1）在培养皿中吸出原液，另存；2）加入PBS，轻轻晃动，吸出PBS，重复三边；3）加入胰酶，轻轻晃动，浸润所有细胞，放入培养箱消化适当时间；4）加入含血清的DMEM培养基终止消化，吹打细胞使之脱落，在液体里反复吹打细胞，放入离心管，收集细胞悬液离心，离心后吸出上清液，上清液另存，留下细胞沉淀，加入新鲜培养液，吹匀细胞，按需接种到新的培养皿，补足培养液进行培养，每2
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3天从培养皿中吸出原液另存，加入等量的培养液，即得F1代细胞及细胞培养原液。
[0012]重复上述1）、2）、3）、4）步骤，即得F2、F3、F4、F5、F6代细胞；在细胞培养过程中从培养皿中抽取的原液和离心的上清液收集保存，经过适当的过滤和浓缩，即得本专利技术外泌体。
[0013]作为优化，培养是取自正常、足月产新生儿脐带，用新洁尔灭、75%酒精、2%青霉素和链霉素的PBS进行消毒、清洗；置于含有2%青链霉素的高糖DMEM培养基中带回实验室进行后续处理；将脐带用生理盐水洗去脐带残留血液，剪成3cm左右小段，多次漂洗，纵行剖开脐带，剔除动静脉血管，剪成小块组织，将组织块置于1.5 mL EP管中，用手术剪将组织块剪成约1mm
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的大小，均匀放置到100mm的培养皿中；将贴有组织块的培养皿置于37℃、5%CO2培养箱；待组织块呈半透明状态时，加入配方液体，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。
[0014]作为优化，细胞传代培养的步骤2）是：加入2mL左右PBS，轻轻晃动，吸出PBS，重复三边；步骤3）是：加入1mL左右的胰酶，轻轻晃动培养基，浸润所有细胞，放入培养箱消化适当时间；步骤4）是：加入1mL含血清的培养基终止消化。
[0015]本专利技术所述促进顽固性压疮愈合的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法是脐带间充质干细胞用含血清的DMEM培养基进行传代过程中的终止消化和用DMEM基培养液培养及传代培养而得，培养液由DMEM培养基85
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95ml和Pall Uleroser G 血清代替物1.5
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2.5ml、中药扛板归黄芪提取液3
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5ml、含燕窝酸300
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500mg的燕窝酸溶液2ml和含有乳铁蛋白0.4
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0.6mg的重组人乳铁蛋白2ml配制而成。培养液由DMEM培养基90ml和Pall Uleroser G 血清代替物2ml、中药扛板归黄芪提取液4ml、含燕窝酸400mg的燕本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进顽固性压疮愈合的脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于是脐带间充质干细胞用含血清的DMEM培养基进行传代过程中的终止消化和用DMEM基培养液培养及传代培养而得，培养液由DMEM培养基85
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95ml和Pall Uleroser G 血清代替物1.5
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2.5ml、中药扛板归黄芪提取液3
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5ml、含燕窝酸300
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500mg的燕窝酸溶液2ml和含有乳铁蛋白0.4
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0.6mg的重组人乳铁蛋白2ml配制而成。2.根据权利要求1所述促进顽固性压疮愈合的脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于培养液由DMEM培养基90ml和Pall Uleroser G 血清代替物2ml、中药扛板归黄芪提取液4ml、含燕窝酸400mg的燕窝酸溶液2ml和含有乳铁蛋白0.5mg的重组人乳铁蛋白2ml配制而成。3.根据权利要求1所述促进顽固性压疮愈合的脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于中药扛板归黄芪提取液是扛板归、黄芪各取等量加4倍水煮两次，收集药液经过滤浓缩、消毒，每100ml扛板归黄芪提取液由黄芪10g、扛板归10g提取而得。4.根据权利要求1所述促进顽固性压疮愈合的脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于所述Pall Uleroser G 血清代替物含生长因子，粘附因子，荷尔蒙，结合蛋白，维生素，微量矿物元素。5.根据权利要求1所述促进顽固性压疮愈合的脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于所述培养是取自正常、足月产新生儿脐带，进行消毒、清洗；置于含青链霉素的高糖DMEM培养基中进行后续处理；将脐带用生理盐水洗去脐带残留血液，剪成小段，多次漂洗，纵行剖开脐带，剔除动静脉血管，剪成小块组织，将组织块置于EP管中，用手术剪将组织块剪成约小块，均匀放置到培养皿中；将贴有组织块的培养皿置于培养箱；待组织块呈半透明状态时，加入培养液，置于培养箱中继续培养；换液：每2
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3天将培养皿中的培养液抽出弃掉，PBS洗三遍，加入新的培养液，置于培养箱中继续培养，取得F0代细胞；细胞传代培养：1）在培养皿中吸出原液，另存；2）加入PBS，轻轻晃动，吸出PBS，重复三边；3）加入胰酶，轻轻晃动，浸润所有细胞，放入培养箱消化适当时间；4）加入含血清的DMEM培养基终止消化，吹打细胞使之脱落，在液体里反复吹打细胞，放入离心管，收集细胞悬液离心，离心后吸出上清液，上清液另存，留下细胞沉淀，加入新鲜培养液，吹匀细胞，按需接种到新的培养皿，补足培养液进行培养，每2
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3天从培养皿中吸出原液另存，加入等量的培养液，即得F1代细胞及细胞培养原液；重复上述1）、2）、3）、4）步骤，即得F2、F3、F4、F5、F6代细胞；在细胞培养过程中从培养皿中抽取的原液和离心的上清液收集保存，经过适当的过滤和浓缩，即得本发明外泌体。6.根据权利要求5所述促进顽固性压疮愈合的脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于培养是取自正常、足月产新生儿脐带，用新洁尔灭、75%酒精、2%青霉素和链霉素的PBS进行消毒、清洗；置于含有2%青链霉素的高糖DMEM...

【专利技术属性】
技术研发人员：温益雄，
申请(专利权)人：温益雄，
类型：发明
国别省市：