一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法及分化鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法及分化鉴定方法，即通过I型胶原酶消化联合组织块培养法提取人脂肪间充质干细胞，将酶消化时间缩短为30min，使组织块变得疏松，利于细胞从组织块中爬出，从而降低常规方法中的胶原酶I对于细胞活力的影响。同时，本发明专利技术能够分离出的人脂肪间充质干细胞产量极高，每1g脂肪大约能分离出4～5

【技术实现步骤摘要】
一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法及分化鉴定方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法及分化鉴定方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，是组织工程的重要组成部分，最早于1974年在骨髓中被发现，主要包括骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞及脐带间充质干细胞等。其中，脂肪间充质干细胞是一种从脂肪组织中获取的间充质干细胞，主要来源于脂肪组织的基质血管部分。Zuk等人在2001年首次利用吸脂术在脂肪中分离出了脂肪间充质干细胞，为干细胞的研究提供了新的方向。脂肪间充质干细胞可以通过分泌细胞因子、脂肪因子、生长因子、血管生成因子和神经营养因子来刺激正常组织功能的恢复或减少损伤，从而促进组织再生和修复。
[0003]与其它间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞具有以下优势：
①
脂肪间充质干细胞提取浓度明显高于骨髓、胚胎、脐带等其它来源的间充质干细胞；
②
脂肪间充质干细胞获得的途径多且方法较为简单；
③
脂肪间充质干细胞体外增殖能力强，更易培养；
④
脂肪间充质干细胞更适合同种异体移植；
⑤
脂肪间充质干细胞受到伦理学的限制较小。
[0004]目前，体外培养脂肪间充质干细胞尚无标准化的方法，大部分研究者采用胶原酶消化法、组织块法及双通脂肪乳糜器提取脂肪间充质干细胞，而基础培养基、胶原酶的种类与浓度、消化时间、离心的转速及时长等都存在差异。由于脂肪间充质干细胞属于脂肪组织中的基质血管成分，在提取的过程中如果消化不完全，就会极大降低提取的浓度，且供体的性别及脂肪组织的提取部位也会影响脂肪间充质干细胞的获取浓度，同时，高龄、肥胖、糖尿病和内分泌治疗等会降低脂肪间充质干细胞的增殖和分化潜能。
[0005]因此，一种能够培养出具有体外增殖能力强且可以多向分化的间充质干细胞的方法亟待研究。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术存在的不足之处，本专利技术提供了一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法及分化鉴定方法。
[0007]本专利技术第一方面提供的一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括：
[0008]获取脂肪组织冲洗至无血色，剪成1mm3大小的碎块；
[0009]通过I型胶原酶对所述脂肪组织碎块进行消化处理；待消化结束后，加入DMEM培养基终止消化，获得消化液；
[0010]离心去除所述消化液的上清，将未消化完全的结构松散的组织块及下层的细胞团重悬，获得细胞重悬液；
[0011]将所述细胞重悬液置于培养皿中并放入培养箱中培养，获得人脂肪间充质干细胞。
[0012]进一步的，所述DMEM培养基包括含体积比为10％的胎牛血清和体积比为1％的青链霉素的低糖DMEM培养基，所述DMEM培养基中还含有摩尔浓度为2mmol/L的谷氨酰胺。
[0013]进一步的，所述通过I型胶原酶对所述脂肪组织碎块进行消化处理，包括：
[0014]向所述脂肪组织碎块中加入与所述脂肪组织碎块体积相同的0.1％I型胶原酶，在37℃的温度下，以180～210rpm的震荡速度震荡消化25～35min，完成对所述脂肪组织碎块的消化处理。
[0015]进一步的，在获得消化液之后，将所述消化液以900～1100r
·
min
‑1的速度离心15～20min，将所述消化液进行离心分离。
[0016]进一步的，在将未消化完全的结构松散的组织块及下层的细胞团重悬时，所用的重悬液与所述DMEM培养基相同。
[0017]进一步的，将所述细胞重悬液置于培养皿中并放入培养箱中培养，包括：
[0018]所述细胞重悬液置于培养皿并放入恒温培养箱内，稳定培养；待细胞融合至80％
‑
90％，按1:3的比例进行传代培养。
[0019]本专利技术第二方面提供的一种人脂肪间充质干细胞的分化鉴定方法，包括：
[0020]将通过上述所述的分离培养方法培养的人脂肪间充质干细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集，并调整细胞浓度至1
×
105个
·
ml
‑1；
[0021]将细胞均匀接种于24孔板上，并在24h后更换成骨诱导液或成脂诱导液，每3d换一次液；
[0022]在分化过程中通过倒置显微镜观察细胞形态学变化。
[0023]进一步的，还包括：
[0024]在所述人脂肪间充质干细胞成骨诱导2w后，细胞爬片；
[0025]用10％中性甲醛固定细胞0.4～0.6h后，加入碱性磷酸酶孵育液，并在37℃恒温箱内孵育至少3h；
[0026]对孵育后的细胞进行水洗、硝酸钴水溶液、以及硫化铵水溶液处理后，在对所述细胞进行脱水和透明处理；
[0027]对经所述脱水和透明处理后的细胞通过中性树胶进行封片处理。
[0028]进一步的，还包括：
[0029]在所述人脂肪间充质干细胞成脂诱导2w后，细胞爬片；
[0030]用10％中性甲醛固定细胞0.4～0.6h后，用60％异丙醇或75％酒精进行漂洗；
[0031]以3：2的体积比配置油红O储备液和蒸馏水的混合液，在室温下，将其混合后静置片刻，滤纸过滤，与固定后的细胞共孵育染色10min；
[0032]将经染色后的细胞爬片进行流水漂洗后，置于载玻片上，再通过甘油明胶对所述细胞进行封片。
[0033]进一步的，所述成骨诱导液含有维生素C 0.2mmol/L、β
‑
甘油磷酸钠10mmol/L、地塞米松10
‑8mol/L、以及体积比为10％FBS的L
‑
DMEM；所述成脂诱导液含有地塞米松0.25μmol/L、吲哚美辛50μmol/L、IBMX 0.5mmol/L、牛胰岛素10μg
·
ml
‑1、L
‑
谷氨酰胺4mmol/L、以及体积比为10％FBS的L
‑
DMEM。
[0034]本专利技术提供的一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法及分化鉴定方法，其中，分离培养方法能够通过I型胶原酶消化联合组织块培养法提取人脂肪间充质干细胞，将酶
消化时间缩短为30min，使组织块变得疏松，利于细胞从组织块中爬出，降低常规方法中的胶原酶I对于细胞活力的影响。同时，本专利技术能够分离出的人脂肪间充质干细胞产量极高，每1g脂肪大约能分离出4～5
×
106个原代细胞，且提取的细胞可以稳定传代，可满足组织工程对种子细胞数量的需求。
[0035]本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
[0036]下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括：获取脂肪组织冲洗至无血色，剪成1mm3大小的碎块；通过I型胶原酶对所述脂肪组织碎块进行消化处理；待消化结束后，加入DMEM培养基终止消化，获得消化液；离心去除所述消化液的上清，将未消化完全的结构松散的组织块及下层的细胞团重悬，获得细胞重悬液；将所述细胞重悬液置于培养皿中并放入培养箱中培养，获得人脂肪间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述DMEM培养基包括含体积比为10％的胎牛血清和体积比为1％的青链霉素的低糖DMEM培养基，所述DMEM培养基中还含有摩尔浓度为2mmol/L的谷氨酰胺。3.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述通过I型胶原酶对所述脂肪组织碎块进行消化处理，包括：向所述脂肪组织碎块中加入与所述脂肪组织碎块体积相同的0.1％I型胶原酶，在37℃的温度下，以180～210rpm的震荡速度震荡消化25～35min，完成对所述脂肪组织碎块的消化处理。4.根据权利要求3所述的分离培养方法，其特征在于，在获得消化液之后，将所述消化液以900～1100r
·
min
‑1的速度离心15～20min，将所述消化液进行离心分离。5.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，在将未消化完全的结构松散的组织块及下层的细胞团重悬时，所用的重悬液与所述DMEM培养基相同。6.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，将所述细胞重悬液置于培养皿中并放入培养箱中培养，包括：所述细胞重悬液置于培养皿并放入恒温培养箱内，稳定培养；待细胞融合至80％
‑
90％，按1:3的比例进行传代培养。7.一种人脂肪间充质干细胞的分化鉴定方法，其特征在于，包括：将通过权利要求1
‑
6中任一项所述的分离培养方法培养的人脂肪间充质干细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨旭芳，梁军，陈培，杨云芳，王文婷，王慧，杨月，
申请(专利权)人：牡丹江医学院，
类型：发明
国别省市：