一种CMM培养基及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种CMM培养基及其应用，所述CMM培养基包括DMEM/F12培养基及占DMEM/F12培养基体积百分比为1

【技术实现步骤摘要】
一种CMM培养基及其应用


[0001]本专利技术涉及一种间充质干细胞完全培养基及其应用，尤其涉及一种犬脐带间充质干细胞完全培养基及其应用，属于动物医学、生物领域。

技术介绍

[0002]兽医学实验和临床中,干细胞在再生医学和组织工程中的应用在都迅速出现。一方面，人类干细胞新疗法的临床前疗效和安全性测试必须使用两种动物物种进行评估，即首先是啮齿动物物种(最好是大鼠)，其次是与人类更相似的非啮齿动物大型动物。间充质干细胞(MSCs)用于人类疾病治疗应用的研究中，一般认为狗优于啮齿动物。与啮齿动物相比，狗在解剖学、发病机制、运动表现和较大关节等方面比啮齿类与人更为相似可以更详细地评估治疗效果。另一方面，狗本身也经常受到疾病的折磨，需要干细胞等新型疗法的介入。到目前为止，许多犬类骨科和神经系统疾病的现有治疗方案通常不能产生预期的临床结果或患者恢复正常功能。因此，MSCs在这一特定领域具有很大的前景。实际上，大量的MSCs已用于兽医和人类细胞治疗。在人类医学中，1
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5百万个细胞/kg被静脉注射或直接注射到组织中。为了获得这种数量级的细胞数量，需要进行培养扩增。目前广泛应用的一般培养方法所获取的间充质干细胞往往存在干性丢失及复制性衰老严重的情况，妨碍了干细胞治疗研究的效果。因此，发展能够大量扩增并能保持干细胞干性的犬间充质干细胞培养方法对于干细胞再生医学研究以及兽医临床实践均有重要意义。

技术实现思路

[0003]专利技术目的：本专利技术的第一目的是提供一种犬脐带间充质干细胞完全培养基CMM培养基；本专利技术的第二目的是提供该CMM培养基在分离培养犬脐带间充质干细胞中的应用；本专利技术的第三目的是提供一种犬脐带间充质干细胞分离培养方法；本专利技术的第四目的是提供一种该CMM培养基分离培养得到的犬脐带间充质干细胞在制备治疗犬关节炎药物中的应用。
[0004]技术方案：本专利技术所述的一种犬脐带间充质干细胞完全培养基为CMM培养基，所述CMM培养基包括DMEM/F12培养基及占DMEM/F12培养基体积百分比为1
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10％的犬富血小板血浆。
[0005]进一步地，还包括10～20μg/L硒元素、55～75mg/L L
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抗坏血酸、200～500μg/L氢化可的松、15～30mg/L肝素、450～500mg/L NaHCO3和250～400mg/L转铁蛋白(Transferrin)。
[0006]进一步地，所述犬富血小板血浆的提取包括以下步骤：将犬抗凝全血离心后分成三层，上层为血清、中层为富含血小板的血浆层、下层为红细胞层；无菌条件下抽取中层的血浆层，获得犬富血小板血浆。
[0007]进一步地，所述离心速率为800
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2000rpm，离心时间为15
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20min。
[0008]本专利技术还包括所述的犬脐带间充质干细胞完全培养基在分离培养犬脐带间充质
干细胞中的应用。
[0009]本专利技术还包括一种犬脐带间充质干细胞分离培养方法，包括以下步骤：
[0010](1)将犬脐带用清洗液清洗，剪成小段，得到犬脐带段；
[0011](2)将犬脐带段中血管去除，剪碎，得到犬脐带碎片；
[0012](3)用消化液消化犬脐带碎片，过筛弃去组织块，得到细胞溶液；
[0013](4)将细胞溶液离心分离，以CMM培养基重悬，得到经CMM培养基处理过的细胞组织；
[0014](5)将细胞组织接种到Magrigel包被的培养皿中，以本专利技术所述的CMM培养基培养即获得犬脐带间充质干细胞。
[0015]进一步地，步骤(1)中，所述清洗液为双倍双抗的PBS溶液，所述双倍双抗为青霉素和链霉素。
[0016]进一步地，步骤(1)中，所述剪成小段为3
‑
5cm。
[0017]进一步地，步骤(3)中，所述消化液为0.2％胶原酶I。
[0018]进一步地，步骤(3)中，所述消化时间为30
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50min。
[0019]进一步地，步骤(3)中，所述过筛为70um细胞筛。
[0020]进一步地，步骤(4)中，所述离心分离速度为1500
‑
2000rpm，离心分离时间为15
‑
30min
[0021]进一步地，步骤(5)中，所述细胞接种量为5
×
104‑5×
105/mL，该接种量指每毫升的CMM培养基中含有5
×
104‑5×
105个细胞。
[0022]本专利技术还包括所述的CMM培养基及所述分离培养方法培养获得的脐带血间充质干细胞在制备治疗犬关节炎药物中的应用。
[0023]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有以下显著优点：本专利技术首次将犬富血小板血浆应用于培养基中获得CMM培养基。应用本专利技术所述的CMM培养基提供的分离培养方法所获得的脐带间充质干细胞有相较于一般的培养方法所获得脐带间充质干细胞有更强的干细胞活性和增值能力。应用本专利技术所述的CMM培养基培养获得的间充质干细胞能够更好的改善关节炎带来的跛行和疼痛，能够更好的改善修复关节功能。
附图说明
[0024]图1为实施例6和对比例5的培养体系下OP和CO细胞倍增时间图；
[0025]图2为OP和CO在第20代时干细胞干性基因OCT4、NANOG、SOX2的表达状态图；
[0026]图3为OP对犬关节炎影响图。
具体实施方式
[0027]下面结合附图进一步对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0028]实施例1犬富小板血浆制备
[0029]犬富血小板血浆通过以下方法获得：通过犬静脉，取全血5
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50毫升，加入肝素抗凝，在1500rpm下离心分离15min，离心液分成三层，上层为血清、中层为富含血小板的血浆层、下层为红细胞层；无菌条件下抽取中层的血浆层，获得犬富血小板血浆。
[0030]实施例2CMM培养基配制
NaHCO3和250mg/LTransferrin。
[0051]对比例4改良后的普通培养基配制
[0052]COM
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2完全培养基，其包括DMEM/F12培养基和占DMEM/F12培养基体积百分比为10％FBS，20μg/L硒元素、75mg/L L
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抗坏血酸、500μg/L氢化可的松、30mg/L肝素、500mg/L NaHCO3和400mg/LTransferrin。
[0053]对比例5普通培养方式及改良环境下犬脐带间充质干细胞分离培养方法以普通培养方式获得了犬脐带间充质干细胞作为比较分析的对照：
[0054](1)获得犬脐带组织后，将犬脐带组织用含有双倍双抗(青霉素200U/mL，链霉素0.2mg/mL)的PBS漂洗干净，将犬脐带组织剪成3
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5cm小段；
[0055](2)分离血管后，将犬脐带组织漂洗干净本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CMM培养基，其特征在于，所述CMM培养基包括DMEM/F12培养基及占DMEM/F12培养基体积百分比为1
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10％的犬富血小板血浆。2.根据权利要求1所述的CMM培养基，其特征在于，所述CMM培养基还包括10～20μg/L硒元素、55～75mg/L L
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抗坏血酸、200～500μg/L氢化可的松、15～30mg/L肝素、450～500mg/L NaHCO3和250～400mg/L转铁蛋白。3.根据权利要求1所述的CMM培养基，其特征在于，所述犬富血小板血浆的提取包括以下步骤：将犬抗凝全血离心后分成三层，无菌条件下抽取中层的血浆层，获得犬富血小板血浆。4.权利要求1
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3任一项所述的CMM培养基在分离培养犬脐带间充质干细胞中的应用。5.一种犬脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将犬脐带用清洗液清洗，剪成小段，得到犬脐带段；(2)将犬脐带段中血管去除，剪碎，得到犬脐带碎片；(3)用消化液消化犬脐带碎片，过筛弃去组织块，得到细胞溶液；(4)将细胞溶液离心分离，以CMM培养基重悬，得到经CMM培养基处理过的细...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁术斌，袁荃，樊德俊，孙博，
申请(专利权)人：江苏银丰生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：