一种制备经血源性间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术属于细胞分离、培养技术领域，公开了一种制备经血源性间充质干细胞的方法。该方法通过将经血样品过10～30目筛，除去血块、大块组织，避免后续离心时影响离心效果；本发明专利技术在传统方法即收集白膜层的基础上，增加收集血细胞层的步骤，同一样本可同时用传统方法和收集血细胞层的方法对密度梯度离心的不同分离层样本进行目的细胞的回收，可以在原有传统方法的基础上提高原代目的细胞的回收率，有利于后期进行生产和建库；且与传统的分离方法相比，通过本发明专利技术方法制备的细胞在后期培养过程中细胞的增殖能力强于传统分离方法的，对于后期在保证细胞质量的前提下，缩短体外培养时间，以实现早期代次的细胞作为制剂产品有着积极地作用。极地作用。

【技术实现步骤摘要】
一种制备经血源性间充质干细胞的方法


[0001]本专利技术属于细胞分离、培养
，具体涉及一种制备经血源性间充质干细胞的方法。

技术介绍

[0002]干细胞治疗所用的细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞等。其中，间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)以其高增殖能力、自我更新能力、向中胚层分化能力、低免疫原性等特点备受研究者瞩目。近年来，间充质干细胞也在免疫调节和组织再生等方面表现出巨大的发展潜能。到目前为止，研究者已从不同人体组织中发现并分离出间充质干细胞。其中子宫内膜会随月经周期发生规律性变化，这种组织高度再生的能力暗示着内膜可能存在促使其重建的干细胞。2004年Chan等从子宫组织中分离并培养出克隆能力强的干细胞，首次证实了子宫内膜干细胞的存在，到2007年Meng等从女性月经血中分离出具有间充质干细胞特性的细胞，称为经血源性间充质干细胞。经血源性间充质干细胞除具备间充质干细胞的特性外还具有取材方便、可定期从统一供体的经血中直接获得，提高细胞遗传背景的稳定性、不受伦理道德限制等优势，因此成为干细胞治疗的优势种子细胞。
[0003]目前经血源性间充质干细胞可以通过组织酶解法和密度梯度离心法从经血中获得。酶解过程中酶解液对细胞的损伤作用不可避免且所用胶原酶试剂价格不菲，实验成本较高。密度梯度离心法根据外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞等细胞的体积、形态和密度与其他细胞不同，如：红细胞和白细胞等细胞密度较大，为1.090g/mL左右，而淋巴细胞和单个核细胞密度为1.075～1.090g/mL，血小板为1.030～1.035g/mL等通过在淋巴细胞分离液中经过密度梯度离心使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将特定密度的血细胞分离出来。但由于宫血中经血源性间充质干细胞从子宫内膜脱落后会以单个细胞、细碎组织和组织块的形式存在，推测密度梯度离心法无法高效富集以不同形式存在的经血源性间充质干细胞，因此，需要寻找一种快速从月经血中高效富集原代经血源性间充质干细胞的方法为其药物研发及生产提供保障。

技术实现思路

[0004]现有技术制备经血源间充质干细胞存在如下问题：由于样本血块及粘稠程度的影响，密度梯度离心分离效果存在较大差异，无法高效简便地富集以不同形式存在的经血源性间充质干细胞，且单纯收集白膜层细胞的细胞回收率较低。
[0005]本专利技术第一方面的目的，在于提供一种制备经血源性间充质干细胞的方法。
[0006]本专利技术第二方面的目的，在于提供一种经血源性间充质干细胞的建库方法。
[0007]本专利技术第三方面的目的，在于提供根据本专利技术第一方面所述方法获得的间充质干细胞。
[0008]本专利技术第四方面的目的，在于提供第三方面的间充质干细胞在制备药物中的应
用。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0010]本专利技术的第一个方面，提供一种制备经血源性间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
[0011](1)、(2)和(31)；或
[0012](1)、(2)和(32)；
[0013](1)取经血样品过10～30目筛，得到滤液；
[0014](2)将滤液进行密度梯度离心，得到四层分离液：血浆层、白膜层、分离液层和血细胞层；
[0015](31)收集白膜层和血细胞层，分别用培养基重悬，得到S1液和S2液，混合，贴壁培养，得到经血源性间充质干细胞；
[0016](32)收集白膜层和血细胞层，混合，用培养基重悬，贴壁培养，得到经血源性间充质干细胞。
[0017]优选地，步骤(1)中所述经血样品为经血与经血保存液的混合液。
[0018]优选地，所述经血为女性月经周期第一天至第四天中至少一天的经血。
[0019]优选地，所述经血为女性月经周期第二天或第三天的中至少一天的经血。
[0020]优选地，所述经血保存液是本领域常用缓冲液，例如PBS缓冲液。可以根据需要添加抗生素和/或抗凝剂。
[0021]优选地，所述抗生素包括但不限于庆大霉素、青霉素、链霉素、两性霉素B等其他常用抗生素或其组合。
[0022]优选地，所述抗凝剂包括但不限于肝素钠、枸橼酸钠等其他常用抗凝剂或其组合。
[0023]优选地，所述经血保存液是包含肝素钠、两性霉素B和庆大霉素的PBS缓冲液。
[0024]优选地，所述庆大霉素为硫酸庆大霉素。
[0025]进一步优选地，所述经血保存液为包含0.1～0.3mg/mL肝素钠、0.1～0.3ug/mL两性霉素B和20～80ug/mL庆大霉素的PBS缓冲液。优选的，所述庆大霉素为硫酸庆大霉素。
[0026]优选地，所述经血与经血保存液的体积比为1:(0.5～1.5)。
[0027]优选地，步骤(1)中所述经血样品过16～25目筛。
[0028]优选地，步骤(1)中所述经血样品过18～20目筛。
[0029]优选地，步骤(2)中所述滤液进行密度梯度离心前还包括如下步骤：预离心，去上清，与清洗液混合。
[0030]优选地，所述预离心的条件为300～500g，15～25℃下离心8～12min。
[0031]优选地，与清洗液混合后得到的混合液的体积为步骤(1)中所述经血样品中经血的体积的1～2倍。
[0032]优选地，步骤(2)中所述密度梯度离心的方法为：将步骤(1)中过筛后滤液或步骤(2)中预离心所制备得到的混合液加入淋巴细胞分离液上，离心。
[0033]优选地，所述滤液或所述混合液与淋巴细胞分离液的体积比为1:(0.5～1.5)。
[0034]优选地，所述离心的条件为200～800g，15～25℃下离心20～40min；进一步为400～600g，15～25℃下离心25～35min。
[0035]优选地，离心过程中所述升降速率调至最低，即升速为1降速为0。
[0036]优选地，步骤(31)、(32)中所述收集白膜层的方法为：去除大部分血浆层，吸出剩余血浆层和白膜层，加入清洗液。
[0037]优选地，步骤(31)、(32)中所述收集血细胞层的方法为过滤法，包括如下步骤：将血细胞层(底层沉淀)与清洗液混合，经40～70um的过滤装置过滤，弃滤液，用清洗液冲洗被截留的物质，收集包含被截留的物质的清洗液。
[0038]优选地，所述用清洗液冲洗被截留的物质之前还包括如下步骤：用清洗液清洗过滤装置，清洗液自然滤过滤膜，弃滤液。
[0039]优选地，所述用清洗液冲洗被截留的物质为正反冲洗；进一步优选为正反冲洗至过滤装置上没有明显组织残留；更进一步优选为正反冲洗1～4次；再进一步优选为正反冲洗2～3次。
[0040]优选地，步骤(31)、(32)中培养基重悬前，还包括如下步骤：离心A、去上清A、重悬、离心B、去上清B。
[0041]优选地，所述离心A、去上清A的操作重复1～3次。
[0042]优选地，几次重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备经血源性间充质干细胞的方法，包括如下步骤：(1)、(2)和(31)；或(1)、(2)和(32)；(1)取经血样品过10～30目筛，得到滤液；(2)将滤液进行密度梯度离心，得到四层分离液：血浆层、白膜层、分离液层和血细胞层；(31)收集白膜层和血细胞层，分别用培养基重悬，得到S1液和S2液，混合，贴壁培养，得到经血源性间充质干细胞；(32)收集白膜层和血细胞层，混合，用培养基重悬，贴壁培养，得到经血源性间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(31)、(32)中所述收集血细胞层的方法为过滤法，包括如下步骤：将血细胞层与清洗液混合，经40～70um的过滤装置过滤，弃滤液，用清洗液冲洗被截留的物质，收集包含被截留的物质的清洗液；优选地，步骤(31)、(32)中所述收集白膜层的方法为：去除大部分血浆层，吸出剩余血浆层和白膜层，加入清洗液；优选地，所述清洗液为缓冲液；进一步为包含抗生素的缓冲液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述经血样品为经血与经血保存液的混合液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述经血为女性月经周期第一天至第四天中至少一天的经血。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王新，
申请(专利权)人：士泽生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：