一种用于检测HLA-DQα1:160D编码基因的引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测HLA

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测HLA
‑
DQ
α
1:160D编码基因的引物组及试剂盒


[0001]本专利技术涉及用于检测HLA
‑
DQα1:160D编码基因的方法和试剂盒，属于生物医学临床分子检测领域。

技术介绍

[0002]HLA位于人类6号染色体短臂的21.31区，约含360万个碱基对，是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最丰富的区域，分为HLA
‑Ⅰ
、Ⅱ和Ⅲ类基因。经典的HLA
‑Ⅰ
类基因包括HLA
‑
A、HLA
‑
B和HLA
‑
C三类，经典的Ⅱ类基因一般指DR、DP和DQ，HLA
‑Ⅲ
类基因与前两类不同，除包含肿瘤坏死因子(Tumour Necrosis Factor，TNF)基因、淋巴毒素α(lymphotoxin alpha，LTA)基因、热休克蛋白基因等具有免疫相关功能的基因外，还包括许多非免疫相关基因。其中，HLA
‑
B是人类基因组中最具多态性的区域，包含超过1600个等位基因。研究报道，HLA与多种疾病密切相关，如强直性脊柱炎、类风湿关节炎、贝赛特氏症、乳糜泻等。
[0003]类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。是最常见的主要累及关节的炎症性疾病，同时也是最常见的自身免疫性疾病，全球的发病率为1％，中国的发病率大约为0.3％。其发病机制尚未完全阐明。普遍认为RA是由环境与基因相互作用以及多基因之间相互作用而导致的一种复杂性疾病。研究表明，RA的遗传度约为60％，提示遗传因素在RA发病中发挥重要作用。在遗传因素中，HLA
‑
DRB1是最为大家所熟知的因素。早期遗传关联研究集中于HLA基因，发现HLA
‑
DRB1与RA的发病显著关联，且各民族之间呈现异质性。HLA
‑
DRB1*04:01是高加索人中主要的RA风险等位基因，而DRB1*04:05是东方人中最常见的RA风险等位基因。除HLA
‑
DRB1外，其他HLA基因，如HLA
‑
B和HLA
‑
DPB1，也被认为与RA的易感性有关。在最新研究中，通过对类风湿关节炎患者MHC区域全覆盖深度测序，发现并首次报道了一个新基因位点(HLA
‑
DQα1:160D)，是我国汉族类风湿关节炎的另一个强相关遗传因素，其易感风险高于已知的HLA
‑
DRB1。
[0004]由此可见，快速而准确地检测HLA
‑
DQα1:160D编码基因对临床疾病辅助诊断、医学研究及疾病病因学研究等具有重要意义。目前常用的上述基因检测方法主要有PCR
‑
SSP法、SYBR Green I、Taqman荧光定量PCR法、测序法等。PCR
‑
SSP(sequence specific primer)即序列特异引物引导的PCR反应，是目前被广泛采用的检测方法，其基本方法是设计一系列等位基因型特异性引物，通过特定PCR反应体系扩增各等位基因型特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，此方法成本低，但操作复杂，无法自动获取结果，准确度也有待提高。SYBR GreenⅠ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其与DNA的结合是非特异性的，此方法虽然操作简便、快速，但缺乏特异性，准确性差。Taqman荧光定量PCR法克服了以上不足，操作简便、快速，特异性高，并可实现高通量检测。测序法可以获得高分辨结果，但临床应用价值不高，价格昂贵、操作复杂、费时。一般来讲，Taqman荧光定量PCR法通过设计一对或多对HLA
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DQα1:160D编码基因特异性引物及相应探针，进行PCR扩增，考虑到HLA多态性非常高，结果易出现假阳性，
从而影响其准确性。因此，本领域急需一种操作简便、快速，且准确度高的检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种用于检测HLA
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DQα1:160D编码基因的方法和试剂盒。
[0006]本专利技术的原理是：本专利技术采用实时荧光PCR结合Taqman探针技术对HLA
‑
DQα1:160D编码基因进行定性检测。根据GENBANK数据库中公布的HLA基因序列，设计了1组HLA
‑
DQα1:160D编码基因特异性引物和探针，以FAM标记，每一次检测进行1管反应，即可检测出HLA
‑
DQα1:160D编码基因。同时管内添加一对内标引物和探针，以HEX标记，可监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果。探针为包括5
’
端报告基团和3
’
端淬灭基团的寡核苷酸，在PCR扩增过程中，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光信号。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5
′→3′
外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，荧光定量PCR仪根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，从而实现对HLA
‑
DQα1:160D编码基因的定性检测。
[0007]HLA约含360万个碱基对，是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最丰富的区域。普通的引物设计方法对于区分HLA基因亚型存在一定局限性，准确性不高，或者需要设计特异性探针，成本较高。我们使用了ARMS引物设计方法，并在传统ARMS基础上进行了改良。我们将引物划为三个区域，5
’
端三分之一区域——弱错配、3
’
端三分之一区域——强错配、中间三分之一区域——中错配。无错配引物检测存在假阳性的情况下，首先设计弱错配引物，如扩增结果准确，则引物可以使用；如扩增结果仍存在假阳性，则设计中错配引物，如扩增结果准确，则引物可以使用；如扩增结果仍存在假阳性，则设计强错配引物，使得3
‘
末端存在突变的基因型无法延伸，准备判断扩增结果。该方法准确性高，操作简便，具有广阔的应用前景。
[0008]本专利技术使用多重Taqman荧光PCR方法，是在同一PCR反应体系里加上二对或以上引物和相应的两条或多条探针，同时扩增出两个或者两个以上核酸片段，鉴定两种或两种以上的靶片段存在与否。运用多重Taqman荧光定量PCR检测，一管多检，准确、高效满足检测需求。
[0009]本专利技术的用于检测HLA
‑
DQα1:160D编码基因的PCR扩增引物组和Taqman探针，包含一对根据HLA
‑
DQα1:160D编码基因特异性序列设计的引物及相应一条探针，序列如下：
[0010]名称序列引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测HLA
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DQα1:160D编码基因的PCR扩增引物组和Taqman探针，其特征在于，所述的PCR扩增引物组和Taqman探针包含一对根据HLA
‑
DQα1:160D编码基因特异性序列设计的引物及相应一条探针，序列如下：名称序列引物15
’‑
TCCAAGTCTACCGTGACA
‑3’
引物25
’‑
CTTGCAGTCATAAATCTAATCAT
‑3’
探针15
’‑
TGGGTCAGCCCAACACCCT
‑3’
所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对内对照引物及相应一条探针，用于监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果，序列如下：名称序列引物35
’‑
CATCTGGACATGCTTGCT
‑3’
引物45
’‑
ACACATGGAAGACCACA
‑3’
探针25'
‑
TGTTAAAGCTCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈炤源，王浩，章婷婷，顾逸飞，
申请(专利权)人：江苏伟禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：