一种包含miR-135b-5p的外泌体及在抗轮状病毒感染中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，尤其涉及轮状病毒外泌体及其应用。目前尚没有关于确认轮状病毒感染宿主细胞后是否分泌外泌体，以及外泌体在病毒复制过程中的调控机制的相关报道。本发明专利技术公开了一种包含miR

【技术实现步骤摘要】
一种包含miR
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135b
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5p的外泌体及在抗轮状病毒感染中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，尤其涉及轮状病毒外泌体及其应用。

技术介绍

[0002]外泌体（Exosomes）是一种由多囊泡体（multivesicular bodies，MVB）与细胞质膜融合后释放的细胞外囊泡，起源于MVB形成过程中的腔内囊泡。具有典型的脂质双分子层结构，直径约为30
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120nm的囊泡，浮密度约1.13
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1.19g/mL。不同细胞分泌的外泌体表面具有一些共同的标记蛋白，如热休克蛋白70（HSC70），热休克蛋白90（HSP90）和四跨膜蛋白CD9、CD63、CD81和CD82等。外泌体中携带多种分子，包括了特异性蛋白家族、功能性mRNA、miRNA。主要通过4种方式在细胞间发挥信息传递作用：(1)外泌体作为信号复合物，通过细胞表面配体直接刺激受体细胞；(2)外泌体在细胞间转移受体；(3)外泌体向受体细胞运送功能蛋白或传染性颗粒；(4)外泌体通过自身携带的mRNA、microRNA或转录因子改变转录和翻译影响受体细胞信息调控。在多个生物学过程肿瘤干细胞的动态平衡，自噬，免疫调节和肿瘤微环境中发挥调控作用。
[0003]轮状病毒（Rotavirus，RV）是引起5岁以下婴幼儿严重腹泻的主要病原体之一。虽然已有相应的疫苗可以预防和控制轮状病毒的感染，但每年由于RV感染引起的儿童肠胃炎病例数仍然达到约1.25亿，导致约20万例儿童死亡。RV属于呼肠孤病毒属，是一种无包膜的二十面体形状的双链RNA病毒。RV基因组不连续，由11个节段(Segment)的双链RNA组成，编码6种结构蛋白(VP1
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4, 6, 7)和6种非结构蛋白(NSP1
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6) ，其中第11段基因编码NSP5和NSP6。完整的感染性病毒颗粒由外层衣壳蛋白（VP4和VP7）、内层衣壳（VP6）和核心（VP1，VP2和VP3）3层结构组成，被称为三层颗粒（triple
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layered particles，TLP）。轮状病毒的结构蛋白和非结构蛋白协同作用，参与病毒基因复制和病毒颗粒组装的不同阶段。
[0004]作为双链RNA病毒，轮状病毒与宿主细胞间存在复杂的相互作用关系，但有关轮状病毒感染宿主细胞后是否分泌外泌体及外泌体在病毒感染过程中的作用和具体调控机制尚未有报道，有待研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题包括确认轮状病毒感染宿主细胞后是否分泌外泌体，以及外泌体在病毒复制过程中的调控机制。
[0006]本专利技术公开了一种包含miR
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5p的外泌体以及这种外泌体在抑制轮状病毒感染中的应用。
[0007]miR
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5p成熟序列表uauggcuuuucauuccuauguga。
[0008]所述外泌体在制备治疗轮状病毒药物中的应用。
[0009]所述外泌体在制备轮状病毒中和试剂中的应用。
[0010]所述miR
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135b
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5p过表达载体，miR
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135b
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5p过表达的外泌体或miR
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135b
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5p过表
达细胞在治疗轮状病毒药物中的应用。
[0011]一种治疗轮状病毒的药物，其特征在于所述药物中包含以下的至少一种：（I）权利要求1所述的外泌体；（Ⅱ）miR
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135b
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5p过表达的外泌体。
[0012]如上所述的药物，其特征在于所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
[0013]一种中和轮状病毒的试剂，其特征在于所述试剂中以下的至少一种：（I）权利要求1所述的外泌体。
[0014]（Ⅱ）miR
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135b
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5p过表达的外泌体。
附图说明
[0015]图1：轮状病毒感染MA104细胞后分离得到的外泌体及标志蛋白检测（A）电镜观察外泌体形态（B）WB检测外泌体中CD63和CD81的表达水平；图2：NTA检测轮状病毒感染MA104细胞后分离得到的外泌体；图3：免疫荧光检测RV
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Exosome对轮状病毒复制的影响（A）RV control（B）Control Exosome+RV（C）Exosome与RV同时加入组（D）RV感染6h后加入外泌体组；图4 轮状病毒感染MA104细胞分泌的外泌体中miRNA的差异表达倍数（前10）；图5： 小RNA测序分析RV
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Exosome中差异miRNA数量；图6：差异miRNA靶基因KEGG分析（A）总的差异miRNAs靶基因KEGG分析（B）Top 20 差异miRNAs靶基因KEGG分析；图7：免疫荧光检测miR
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5p对轮状病毒复制的影响（A）RV control（B）阴性对照小RNA组（C）miR
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5p上调组（D）miR
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5p下调组；图8：Western blot检测miR
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5p对轮状病毒VP7蛋白复制的影响图9：外泌体在乳鼠腹泻模型中的作用
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腹泻评分。MOCK为模型对照组（未治疗组），C
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EXO为空白对照细胞分离外泌体治疗组，RV
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EXO为病毒感染细胞分离外泌体治疗组。
具体实施方式
[0016]实施例1、RV感染分泌的外泌体生物学性质分析，将野生型轮状病毒强毒株ZTR
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68株（G1[8]型）感染MA104细胞后，收集上清，采用超滤离心和磁珠分选等外泌体分离步骤进行操作，希望分离到轮状病毒感染产生的外泌体。将收集的分离物通过NTA对外泌体进行粒径分析，鉴定分离物颗粒大小及浓度；通过电镜观察分离物的大小及形态；提取外泌体样品的蛋白，通过WB检测外泌体标志物CD63、CD81，Alix和CD9在分离物中的表达情况。
[0017]分离物透射电镜结果显示，分离物颗粒大小约为140nm，具有膜结构，符合外泌体特征（图1A）。通过纳米粒子分析（NTA）分析分离物的纯度和大小，结果显示，轮状病毒感染MA104细胞后分泌物为外泌体，大小约为140nm，含量为5
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106纯度达到98%（图2）。WB检测结果显示，分离物高表达CD63，表达CD9、CD81和Alix，符合外泌体标记物特征（图1B）。
[0018]实施例2、外泌体在RV复制中的体外作用在确认分离物为RV感染细胞，细胞能够释放外泌体后，进一步分析外泌体对RV的感染和复制的作用。为分析外泌体在RV中是否发挥作用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体，其特征在于所述外泌体包含小RNAmiR
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5p。2.如权利要求1所述外泌体在制备治疗轮状病毒药物中的应用。3.如权利要求1所述外泌体在制备轮状病毒中和试剂中的应用。4.如权利要求1所述miR
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5p过表达载体，miR
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5p过表达的外泌体或miR
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【专利技术属性】
技术研发人员：周艳，李鸿钧，胡晓青，陈蓉，吴晋元，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：