一种同时实现囊胚非整倍体检测和高着床潜能筛选的方法技术

本发明专利技术公开了一种可同时实现囊胚非整倍体检测和高着床潜能筛选的方法，该方法不仅可以检测全基因组的拷贝数变异，完成PGT

【技术实现步骤摘要】
一种同时实现囊胚非整倍体检测和高着床潜能筛选的方法


[0001]本专利技术涉及医学检测领域，更为具体的，本专利技术涉及一种囊胚非整倍体检测和高着床潜能筛选的方法。

技术介绍

[0002]体外受精及胚胎移植是解决临床不孕不育的一个重要手段，通过在体外得到胚胎，并挑选优质胚胎移植从而为不孕不育患者得到后代。在此过程中，临床中结合胚胎着床前遗传学检测（Preimplantation Genetic Testing，PGT）技术和胚胎形态学检查，筛选染色体整倍体及发育形态较好的胚胎进行移植，可以用于提高临床妊娠率，得到更好的临床结局。
[0003]根据检测类型的不同，目前PGT主要分为胚胎着床前非整倍体检测（Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy，PGT
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A，也叫拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）检测）、胚胎着床前单基因病检测（Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Diseases，PGT
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M）和胚胎着床前染色体结构变异检测（Preimplantation Genetic Testing for Chromosomal Structural Rearrangements，PGT
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SR）。
[0004]PGT
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A是临床中最常用的一种染色体筛查技术，可以对胚胎染色体进行整倍性检测，选择染色体数目正常的胚胎进行移植，从而提高临床妊娠率和活产率，该技术此前被称为“PGS
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（Preimplantation Genetic Screening）。在临床体外受精的患者中，高龄（年龄>35岁）及反复移植失败患者胚胎的非整倍体比例较高，对于这些患者PGT
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A具有重要意义。目前临床中PGT
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A技术主要通过基因组测序或基因组杂交芯片检测胚胎染色体数目，利用甲基化等表观遗传层面检测染色体数量的方法相对匮乏。随着单细胞测序技术的发展与进步，已有研究对人早期胚胎发育各时期的表观遗传组进行了探索，发现早期胚胎发育中发生广泛的表观遗传重编程和转录调控，可控制胚胎发育和后续着床，但是这些研究缺乏胚胎移植及后续发育相关信息，无法使用这些数据对胚胎后续着床及发育结局进行预测。
[0005]在进行PGT
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A得到整倍体胚胎后，一般需要进一步根据胚胎形态学挑选形态较好的胚胎移植。胚胎形态学检查是目前评估胚胎着床及发育潜能的一个常用指标。然而，即使经过PGT
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A和形态学筛选的胚胎，在移植后也存在30%
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50%的妊娠失败率，无法高效地挑选出可在母体子宫着床及发育的优质胚胎。因此对胚胎着床及后续发育潜能的预测具有重要临床意义。
[0006]专利CN105543339B公布了一种同时完成基因位点、染色体及连锁分析的诊断方法。该专利对突变位点周围的SNP位点根据人群杂合度进行挑选，使用多重PCR预扩增挑选的SNP位点，然后将多重PCR预扩增产物和胚胎扩增产物混合后构建二代测序文库。进行二代测序后，使用全基因组测序的数据进行PGT
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A，使用突变位点周围的SNP位点进行连锁分析。该技术可以很好地对胚胎的整倍性及变异位点进行检测，但是缺乏对胚胎发育潜能的预测，无法挑选高着床和发育潜能胚胎。文章https://genome.cshlp.org/content/early/
2019/09/23/gr.252981.119中构建了一种可以同时评估胚胎染色体核型和发育潜能的方法。该文章结合囊胚转录组信息与胚胎染色体核型、胚胎形态和胚胎动力学，以整倍体胚胎和形态优良胚胎为高发育潜能胚胎，构建预测模型。对囊胚滋养层细胞进行转录组测序（RNA
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seq），获得基因表达信息，推导胚胎染色体核型和其发育潜能。该方法通过转录组推断染色体整倍性，由于囊胚细胞中转录组变异较大且不均匀，该方法在用于实现PGT
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A染色体非整倍体检测中准确率较低。此外，该预测方法的构建中仅根据核型、胚胎形态及动力学，缺乏临床中真正胚胎移植信息，没有胚胎移植结局，没有在实践中进行应用，实际预测效果未知，具有一定的局限性。专利CN105861658A（所对应文章为https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1673
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8527(17)30140
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6）公布了一种通过囊胚甲基化的整体水平高低来区别优质胚胎和非优质胚胎的方法。该方法通过囊胚活检获得滋养层细胞，并对活检的滋养层细胞进行甲基化测序，得到胚胎的整体甲基化水平。并结合加纳德形态囊胚分级镜下筛选形态优良囊胚（形态学评级AA），以形态学评级为AA的优良囊胚的甲基化水平为标准（其认为形态学AA评级的囊胚发育潜能更高），建立高发育潜能胚胎的甲基化数据模型并同时根据甲基化水平筛选高发育潜能的胚胎进行移植。该专利技术只是以形态学评级为AA的胚胎作为标准参考，认为其甲基化水平预示高的着床和发育潜能，但是临床上很多AB、BA、BB评级的胚胎，仍然可以顺利着床和发育。这种方法局限了胚胎的应用，浪费了很多实际具有着床和发育潜能的胚胎。
[0007]因此目前在临床中，仍然缺乏一种可以同时进行PGT
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A染色体整倍性检测和高着床及发育潜能胚胎筛选的方法。

技术实现思路

[0008]为了填补现有技术的空白，本专利技术提供一种同时对染色体整倍体和优良发育潜能囊胚筛选的检测方法，该方法使用单细胞甲基化测序实现囊胚着床前染色体非整倍性遗传学检测和囊胚发育潜能预测，挑选染色体整倍体及高着床潜能囊胚用于后续移植。为了实现上述技术效果，本专利技术具体提供如下的技术方案：本专利技术的第一个方面，提供一种同时实现囊胚非整倍体检测（PGT
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A）和高着床潜能筛选的方法，所述方法包括如下步骤：1. 获取1
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3个囊胚滋养层细胞作为检测样本；2. 裂解胚囊滋养层细胞，获得细胞内DNA；3. 将DNA进行亚硫酸氢盐转化；4. 亚硫酸氢盐转化后代的DNA产物文库构建；5. 对构建的甲基化文库进行测序，得到胚胎甲基化数据；6. 数据分析及着床潜能预测：（1）去除甲基化数据测序接头、低质量碱基、过短的序列；（2）使用人类参考基因组作为对照，使用甲基化比对软件将上一步所得序列与人类参考基因组进行比对，比对后所得bam文件，去除非唯一比对序列及重复序列，将处理后的bam文件使用readCounter对基因组每个位置的序列数进行计数，得到每个位置的序列数，然后使用Hmmcopy软件进行CNV计算，得到每个样本的CNV结果，实现PGT
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A；（3）使用bismark_extractor计算每个样本在每个覆盖到的CG位点的甲基化水平，
进一步将样本全基因组从5...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
0.6693682018249012,
ꢀ‑
0.6606863750100334, 0.7006178980344422,
ꢀ‑
0.6718163228307065, 0.796302059...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔杰，严智强，杨铭，闫丽盈，朱小辉，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：