非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组、双重RT

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于动物病原分子诊断
，具体涉及一种非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的猪的一种急性、高度传染性、高致死率的传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血为特征。所有年龄段的猪都易感，易感猪群的病死率甚至高达100％，对养猪业危害极大，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的A类动物疫病，我国将其列为重点防控的一类动物疫病。
[0003]ASFV除感染家猪外还能感染野猪和软蜱，可在这三者之间循环传播；加之存在隐性感染猪，以及受ASFV污染的生猪产品的流通，使得该病的传播非常迅速。ASFV在1921年首次在非洲肯尼亚发现后(Eustace Montgomery,1921)，1957年传入欧洲葡萄牙，70～80年代传到欧洲和美洲(Plowright,Parker et al.1969)，2007年先后在格鲁吉亚、亚美尼亚、俄罗斯爆发ASF疫情。不到一个世纪的时间，该病从非洲起始几乎传遍全球。2018年，自我国在辽宁省首次报道ASF疫情后，疫情迅速蔓延至全国，不仅给我国养猪业带来巨大的经济损失，而且作为全球最大的猪肉消费国，非洲猪瘟对我国国民生活的影响也是相当大的。
[0004]目前，ASF尚无有效的治疗方法，短期内亦无安全高效的疫苗用于防控，其防控仍然依赖于快速、准确的诊断和扑杀。ASF在临床症状上与猪瘟和高致病性猪繁殖与呼吸综合征难以区分，因此建立快速、准确的检测方法对于该病的防控至关重要。目前用于ASFV的检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金试纸条和核酸检测法。随着分子诊断技术的飞速发展，荧光定量PCR技术不仅有很高的敏感性和特异性，且能实现高通量检测大量样本，在分子诊断领域成为首选主流技术。目前国内已有多种荧光定量PCR试剂盒产品应用于ASFV的检测，检测的靶标基本集中在ASFV的主要结构蛋白编码基因VP72上。
[0005]影响荧光定量PCR检测效果的因素主要有三方面：一是标本因素，标本的采集部位、标本保存方法和保存时间等都会影响到检测时的靶标含量；二是人员因素，实验人员的技术水平和在实际操作过程中的操作习惯等对检测结果有直接影响；三是仪器因素，设备的稳定性、升降温速度、激发光源强度、软件算法等也会对检测结果的判定有影响。后两个因素可以人为控制，但第一个因素主要由疾病发生发展过程和宿主状态决定，很难人为控制。当国内开始出现ASFV流行毒株强毒变弱的趋势时，被感染猪的病程延长，潜伏期增加，采样部位的病毒载体也大幅减少，对检测的第一个关键因素影响很大，使得ASFV的检测难度更大。
[0006]我们可根据其基因组DNA的复制这一事件将病毒增殖周期分为复制前阶段和复制后阶段。在病毒基因组进行大量复制前，机体感染细胞内的病毒相关DNA的数量很少，如果感染过程延长，感染部位病毒数量少，那么即便是最主要的病毒结构编码基因，拷贝数也可能低于可检测的阈值，这也正是为什么ASFV天然弱毒株检测难度更高的原因。因此，急需开
发一种提高ASFV天然弱毒株检测敏感性和特异性的方法和检测试剂盒。

技术实现思路

[0007]为解决目前ASFV天然弱毒株检测难度高的难题，本专利技术筛选出ASFV结构蛋白编码基因之外，病毒感染早期DNA复制前转录丰度高的mRNA序列作为荧光定量PCR的检测靶标，在荧光定量PCR过程中加上一步逆转录，通过一步法RT
‑
qPCR实现ASFV，尤其是ASFV天然弱毒株的检测，不仅将ASFV感染猪能检测到排毒的时间点尽可能的提前，最大效率的辅助猪场实施ASF的“拔牙”净化策略，而且即便用于检测ASFV病毒的结构蛋白编码基因，其扩增的RNA模板数量也远远超过DNA模板的拷贝数，大大提高ASFV，尤其是ASFV天然弱毒株的分子检测敏感性。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供一种非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组，所述引物探针组包括以下两套引物探针组：
[0009]a引物探针组：用于检测非洲猪瘟病毒P72基因mRNA和DNA的引物探针组，所述P72基因的序列为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；
[0010]b引物探针组：用于检测非洲猪瘟病毒A151R基因mRNA的引物探针组，所述A151R基因的序列为SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。
[0011]优选的，所述a引物探针组包括：上游引物为SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，下游引物为SEQIDNO：4所示的核苷酸序列，探针为SEQIDNO：5所示的核苷酸序列；所述b引物探针组：上游引物为SEQIDNO：6所示的核苷酸序列，下游引物为SEQIDNO：7所示的核苷酸序列，探针为SEQIDNO：8所示的核苷酸序列。
[0012]优选的，所述a引物探针组中的探针的5
’
端标记有荧光报告基团FAM、3
’
端标记有荧光淬灭基团BHQ1，所述b引物探针组中的探针的5
’
端标记有荧光报告基团VIC、3
’
端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
[0013]本专利技术还提供一种非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括上述非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组。
[0014]优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、缓冲液、RNase抑制剂、dNTP、酶混合液、无核酸酶水。
[0015]优选的，所述阳性对照品为含有整合P72基因序列和A151R基因序列的阳性质粒pMD
‑
312151的TE缓冲液，所述TE缓冲液中的阳性质粒pMD
‑
312151含量为1
×
105copies/μL；所述阴性对照为无菌水。
[0016]本专利技术还提供一种非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测方法，应用上述非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒检测非洲猪瘟病毒，包括以下步骤：
[0017]A、提取待检样本模板；
[0018]B、配制RT
‑
qPCR反应体系；
[0019]C、PCR扩增及检测；
[0020]D、结果判定。
[0021]优选的，所述RT
‑
qPCR反应体系总体积为25μL，其中包括无核酸酶水13.55μL、10
×
缓冲液2.5μL、25mM的dNTP 0.2μL、100
×
RNase抑制剂0.25μL、酶混合液1μL、20倍终浓度的a引物探针组1.25μL、20倍终浓度的b引物探针组1.25μL、扩增模板5μL。
[0022]优选的，所述PCR扩增及检测反应条件为：逆转录50℃15min；预变性95℃2min；循环扩增95℃10s，57℃30s，重复45个循环。
[0023]优选的，所述结果判定如下：
[0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括以下两套引物探针组：a引物探针组：用于检测非洲猪瘟病毒P72基因mRNA和DNA的引物探针组，所述P72基因的序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；b引物探针组：用于检测非洲猪瘟病毒A151R基因mRNA的引物探针组，所述A151R基因的序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组，其特征在于，所述a引物探针组包括：上游引物为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，下游引物为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，探针为SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；所述b引物探针组：上游引物为SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，下游引物为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，探针为SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组，其特征在于，所述a引物探针组中的探针的5
’
端标记有荧光报告基团FAM、3
’
端标记有荧光淬灭基团BHQ1，所述b引物探针组中的探针的5
’
端标记有荧光报告基团VIC、3
’
端标记有荧光淬灭基团BHQ1。4.一种非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组。5.根据权利要求4所述的非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、缓冲液、RNase抑制剂、dNTP、酶混合液、无核酸酶水。6.根据权利要求5所述的非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有整合P72基因序列和A151R基因序列的阳性质粒pMD
‑
3...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈利苹，杨奇贤，
申请(专利权)人：深圳市博德致远生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：