一种寡聚核苷酸混合物、荧光RT-PCR检测试剂及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种寡聚核苷酸混合物、荧光RT

【技术实现步骤摘要】
一种寡聚核苷酸混合物、荧光RT
‑
PCR检测试剂及应用


[0001]本专利技术涉及病原微生物检测技术，具体涉及一种寡聚核苷酸混合物、荧光RT
‑
PCR检测试剂及应用。

技术介绍

[0002]人副流感病毒(Human parainfluenza viruses，HPIVs)是引起上呼吸道感染(如普通感冒和喉咙痛)最常见的病原体之一(其它还有鼻病毒、冠状病毒、腺病毒等)，也能造成反复的下呼吸道疾病(如肺炎、支气管炎和细支气管炎)，人群普遍易感，特别是儿童、老人和有免疫缺陷人群。据统计，大约1/3的婴幼儿急性呼吸道感染都是由HPIVs引起的。HPIVs能通过接触传染性污染物或吸入污染物的飞沫而传播，由人的眼睛、口腔或鼻腔等部位进入人体，引起感染。
[0003]HPIVs属于副粘病毒科(Paramyxoviridae family)副粘病毒亚科(Paramyxovirinae subfamily)，根据遗传性与抗原性分为四种血清型，即1
‑
4型(HPIV1
‑
4)，其中HPIV1和HPIV3属于呼吸道病毒属(Respirovirus genus)，而PIV2和PIV4属于腮腺炎病毒属(Rubulavirus genus)。
[0004]HPIV粒子有包膜，直径150
‑
300nm，基因组由不分节段的单股负链RNA组成，长约15000个核苷酸，编码6种结构蛋白(3
’‑
N
‑
P
‑
C
‑
M
‑
F
‑
HN
‑
L
‑5’
)。包膜内为核衣壳，由病毒RNA、N蛋白、P蛋白和L蛋白组成。包膜上有两种刺突，分别是HN蛋白和F蛋白，各血清型的抗原特征主要由HN蛋白区分。
[0005]各血清型有不同的临床和流行病学特点。HPIV1和HPIV2能造成上、下呼吸道感染，引起假膜性喉炎、气管炎或支气管炎等疾病，其中HPIV1是儿童喉气管支气管炎的主要原因，HPIV2次之；HPIV3是引起婴儿支气管炎和肺炎的主要病原体之一(仅次于呼吸道合胞病毒)，也可导致假膜性喉炎，在1岁以下儿童中症状最严重；HPIV4一般引起轻微的上呼吸道疾病，重症报道较少。HPIV1
‑
3引起呼吸道疾病的报道都比较常见，其中HPIV1一般为隔年发生一次较大的交替流行，各地都可发病。据报道，5岁及以上儿童有90％以上有抗HPIV3的抗体，约75％有抗HPIV1和HPIV2的抗体。所以在医疗卫生领域，对HPIV1
‑
3的诊断和监测最为重要。
[0006]HPIVs的体外检测通常是通过对样本中的HPIVs进行分离培养、免疫检测和核酸检测等方法实现。分离培养虽为“金标准”，但操作复杂、耗时长、灵敏度不稳定；免疫检测则特异性差、敏感性低。以荧光RT
‑
PCR技术为代表的核酸检测法因其准确、灵敏、快速等特点，已被越来越多地应用于辅助诊断呼吸道病毒感染相关疾病，是目前HPIVs主要确诊方法。但是，随着新发表的HPIVs核酸序列不断增加，经过序列比对分析可见，现有HPIVs荧光RT
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PCR检测试剂的引物探针序列存在不同程度的错配，具有较大的漏检风险。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是：提供一种寡聚核苷酸混合物和荧光RT
‑
PCR检测试剂，可用于更
准确检测样本中的HPIVs。
[0008]本专利技术所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：
[0009]1.引物、探针的设计方案
[0010]本专利技术根据GenBank最新的核酸信息设计并筛选出三组寡聚核苷酸分别作为HPIV1、HPIV2和HPIV3的特异性引物探针组合，用于本专利技术提供的荧光RT
‑
PCR检测试剂中。本专利技术所用的寡聚核苷酸序列如表1所示，其中：
[0011]检测HPIV1的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，即寡聚核苷酸组合A；
[0012]检测HPIV2的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列分别为SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，即寡聚核苷酸组合B；
[0013]检测HPIV3的正向引物的核苷酸序列为SEQ ID No.7，反向引物1和2的核苷酸序列为SEQ ID No.8和SEQ ID No.9(两条反向引物是针对所在位置的单核苷酸多态性而设计，可按一定比例混合后使用)，探针的核苷酸序列为SEQ ID No.10，即寡聚核苷酸组合C。
[0014]本专利技术所述的荧光RT
‑
PCR检测试剂可以以HPIV1、HPIV2和HPIV3中的一个或多个作为检测对象并选用相应的引物探针组合，优选同时以HPIV1、HPIV2和HPIV3作为检测对象。
[0015]所述荧光RT
‑
PCR检测试剂中还可添加人RNase P的特异性引物探针，作为检测的内标，用于监测采样质量和核酸提取效果。
[0016]上述人RNase P的特异性引物探针中的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列分别为SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13。
[0017]上述的检测HPIV1、HPIV2、HPIV3及人RNase P的引物和探针序列在各自的检测对象的已知核酸序列中高度保守，且对非目标检测对象具有排他性，因而能有效防止漏检(假阴性)和错检(假阳性)。
[0018]上述的检测HPIV1、HPIV2、HPIV3及人RNase P的探针的5
’
端用荧光报告基团修饰，3
’
端用荧光淬灭基团修饰。荧光报告基团可从FAM、JOE、HEX、VIC、NED、TET、ROX、Cy5中选择；HPIV1和HPIV2的探针的荧光淬灭基团为MGB，HPIV3和人RNase P的探针的荧光淬灭基团可从BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA和Eclipse中选择。
[0019]若对HPIV1
‑
3进行通用型检测，则HPIV1、HPIV2和HPIV3的探针用相同通道的荧光报告基团修饰；若对HPIV1、HPIV2和HPIV3进行分型检测，则HPIV1、HPIV2和HPIV3的探针用不同通道的荧光报告基团修饰。作为优选，HPIV1、HPIV2和HPIV3的探针的荧光报告基团均选用FAM，HPIV3的荧光淬灭基团选用BHQ1；人RNase P的探针的荧光报告基团选用VIC，荧光淬灭基团选用BHQ1。
[0020]表1.本专利技术涉及的寡聚核苷酸序列
[0021]编号核苷酸序列(5
’‑3’
)SEQ ID No.1ATCACTCAAGGATGTGCAGATATAGGSEQ ID No.2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种寡聚核苷酸混合物，其特征在于，含有以下寡聚核苷酸组合A、B、C中的一个或多个：寡聚核苷酸组合A，由三条寡聚核苷酸组成，序列分别为SEQ ID No.1、2、3，其中序列为SEQ ID No.3的寡聚核苷酸的5
’
端和3
’
端分别用荧光报告基团和MGB基团修饰；寡聚核苷酸组合B，由三条寡聚核苷酸组成，序列分别为SEQ ID No.4、5、6，其中序列为SEQ ID No.6的寡聚核苷酸的5
’
端和3
’
端分别用荧光报告基团和MGB基团修饰；寡聚核苷酸组合C，由四条寡聚核苷酸组成，序列分别为SEQ ID No.7、8、9、10，其中序列为SEQ ID No.10的寡聚核苷酸的5
’
端和3
’
端分别用荧光报告基团和荧光淬灭基团修饰。2.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸混合物，其特征在于，所述荧光报告基团从FAM、JOE、HEX、VIC、NED、TET、ROX、Cy5中选择。3.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎绍基，林镜中，朱碧莹，刘钰涵，
申请(专利权)人：深圳市赛格诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：