一种制备人乳头瘤病毒捕获探针组的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种制备高危型人乳头瘤病毒捕获探针组的方法及其应用，属于基因检测及分子遗传学领域；本发明专利技术通过以15种高危型质粒:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68为模板，利用滚环扩增的方法扩增出覆盖HPV全长的扩增产物；进一步将扩增产物超声打断至不同需求的长度，即为能特异性捕获15种HPV基因组的探针；本发明专利技术能降低HPV捕获探针组制备成本，并能缩短探针组制备周期。同时，本发明专利技术的探针组能够准确的检测高危型HPV的感染及整合状态。染及整合状态。

【技术实现步骤摘要】
一种制备人乳头瘤病毒捕获探针组的方法及其应用

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[0001]本专利技术属于基因检测及分子遗传学领域，具体涉及一种可用于15种高危型人乳头瘤病毒基因组捕获探针的制备方法及其应用。

技术介绍
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[0002]宫颈癌是指发生于子宫颈阴道和宫颈部的恶性肿瘤，是最常见的妇科恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌。人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)是一种无被膜包被的环状双链小分子DNA病毒，基因组长约8000碱基对(base pair,bp)。大量研究表明，高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68)持续感染是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。尽管如此，不是每一个感染高危型HPV的患者均发生了宫颈癌。随着分子生物学和细胞遗传学的进展，科学研究发现HPV DNA与宫颈上皮细胞基因组整合事件的发生才是宫颈癌发生过程中的重要环节。HPV DNA一旦插入到宫颈上皮细胞基因组中，HPV DNA序列将会随着人基因组的复制不断复制，引起癌蛋白的持续表达。同时，宫颈上皮细胞基因组结构及相关基因的表达水平会发生变化，增加上皮细胞基因组的不稳定性，导致宫颈上皮细胞功能异常、分裂失控，最终致癌。目前，HPV基因组整合事件是宫颈上皮内瘤变向宫颈癌恶性转化的一个重要标志已得到一致认可。在HPV导致的良性病变中，细胞内的病毒DNA通常以游离形式位于宫颈上皮基因组外。在高级别病变和宫颈癌中，HPV DNA通常以整合形式插入至上皮细胞基因组中，且整合率随着宫颈病变的严重程度而显著增加。因此，HPV与人基因组整合可作为宫颈高级别病变及宫颈癌的辅助诊断手段。高通量测序技术结合靶向捕获技术是目前检测HPV整合状态最为准确的方法。HPV靶向捕获的核心材料之一是HPV DNA捕获探针，目前市场上主要DNA捕获探针生产厂商有罗氏(Roche)、IDT(Integrated DNATechnologies)、Twist Bioscience，目前三家公司都是采用直接合成oligo的方案。然而，直接合成探针方案的成本较高，引起DNA探针市场价格居高不下，且合成周期长。

技术实现思路
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[0003]针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种用于高危型人乳头瘤病毒基因组捕获探针组的制备方法及其应用。所述制备方法简单、产量大、成本低，可将制备周期缩短至1天。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0005]一种制备用于高危型HPV基因组捕获测序的DNA捕获探针的方法，依次包括如下步骤：
[0006](1)合成15种高危型HPV:HPV16(SEQ ID NO.1)、18(SEQ ID NO.2)、31(SEQ ID NO.3)、33(SEQ ID NO.4)、35(SEQ ID NO.5)、39(SEQ ID NO.6)、45(SEQ ID NO.7)、51(SEQ ID NO.8)、52(SEQ ID NO.9)、53(SEQ ID NO.10)、56(SEQ ID NO.11)、58(SEQ ID NO.12)、59(SEQ ID NO.13)、66(SEQ ID NO.14)和68(SEQ ID NO.15)，并克隆至pUC57载体；
[0007](2)合成扩增引物，所述引物的核苷酸序列为:SEQ ID NO.16；
[0008](3)使用修饰标记的dNTP为原料、以步骤(1)所述的质粒分别为模板，用步骤(2)所述的引物进行滚环式扩增；
[0009](4)获得的扩增产物定量，并混合；
[0010](5)纯化步骤(4)获得的混合产物并用超声打断仪打断；
[0011]滚环扩增是一种扩增效率高于PCR的高效扩增体系，通常1ng的DNA可以得到1
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10μg的产物；并且扩增过程中很少引入突变；避免了目前探针合成面临的累计错误率的问题，因此得到的探针的均一性非常高。
[0012]另外，在合成DNA探针的过程中，由于合成受技术的限制，很难合成长片段探针，目前合成的探针长度一般不超过150nt。除去用于扩增探针的两端引物序列，一般有效探针长度为120nt。本专利技术方法制备的HPV DNA探针，长度可达数十kb，并且可以通过超声打断的方法打断至所需任意长度。
[0013]作为本专利技术的优选实施方式，步骤(3)所述dNTP包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP，其中只有dUTP带生物素标签(biotin
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dUTP)。
[0014]更优选地，所述dTTP：biotin
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dUTP的摩尔数用量比为4:1；所述(biotin
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dUTP+dTTP)：dATP：dGTP：dCTP的摩尔数用量比为1:1:1:1。
[0015]作为本专利技术的优选实施方式，制备HPV DNA探针时，步骤(3)中所述滚环扩增使用的DNA聚合酶为Phi29 DNA聚合酶。
[0016]作为本专利技术的优选实施方式，步骤(4)中所述超声为将扩增产物打断至200～400nt。
[0017]进一步地，所述超声的参数设置为：打断60个循环(超声20秒，停30s)。
[0018]本专利技术的第二目的在于，公开了所述方法制备的15种高危型HPV捕获探针。
[0019]本专利技术的第三目的在于，公开了所述探针在靶向捕获测序中的用途。
[0020]进一步地，本专利技术提供了利用上述方法制备的HPV探针的靶向HPV基因组测序的方法，方法如下：
[0021](1)样本DNA提取、片段化及构建DNA文库
[0022](2)文库目标区域靶向捕获及定量
[0023](3)高通量测序
[0024](4)基因序列的生物信息分析
[0025]本专利技术的优点是：
[0026](1)本专利技术方法可用于生产HPV DNA捕获探针，制备方法简单、产量大、成本低，可将制备周期缩短至1天。
[0027](2)另外，本专利技术方法制备的探针长度不受限，可根据需要提供不同目标及不同长度的探针，以满足不同的探针需求。
附图说明
[0028]图1为本专利技术实施例1滚环扩增产物凝胶电泳结果。
具体实施方式
[0029]为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对
本专利技术作进一步说明。
[0030]实施例1
[0031]本专利技术方法制备高危型HPV DNA探针的一种实施例，制备方法如下：
[0032]1、构建含有15种高危型HPV DNA序列的pUC57质粒：
[0033](1)高危型HPV序列(参考序列来自NCBI数据库)由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。
[0034](2)分别将合成的HPV DNA序列克隆至pUC57载体，获得15种高危型HPV质粒。
[0035]2、滚环扩增与纯化
[0036](1)配制反应体系：2uL Phi29DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备高危型人乳头瘤病毒捕获探针组的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、合成15种高危型HPV的DNA序列，并构建载体，所述高危型HPV为：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68中的一种或多种；(2)、合成扩增引物；(3)、使用修饰标记的dNTP为原料、以步骤(1)的质粒分别为模板，用步骤(2)所述的引物进行滚环式扩增；(4)、获得的扩增产物定量，并混合；(5)、纯化步骤(4)获得的混合产物并用超声打断仪打断。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述15种高危型HPV的DNA序列为：SEQ ID NO.1
‑
15中的一种或多种。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述引物的序列为：SEQ ID NO.16。4.如权利要求1或2所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈世民，杨帆，何良，王志杰，黄晓园，
申请(专利权)人：武汉凯德维斯医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：