一种FAdV-4NP株特异性引物及其在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种FAdV

【技术实现步骤摘要】
一种FAdV
‑
4 NP株特异性引物及其在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用


[0001]本专利技术属于畜牧兽医
，具体涉及一种FAdV
‑
4 NP株特异性引物及其在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用。

技术介绍

[0002]禽腺病毒（Fowl adenovirus, FAdV）是腺病毒科腺病毒属的一员。血清4型禽腺病毒（FAdV
‑
4）感染可引起包涵体肝炎
‑
心包积液综合征（hydropericardium hepatitis syndrome, HHS）。1987年在巴基斯坦的安卡拉地区该病被首次报道，因此，又被称为安卡拉病。自2015年夏季开始在我国出现较大范围的爆发。该病的典型病变特征是心脏肿胀、出血，心包内有大量的黄色透明液体或胶冻样渗出物，肝肿大、出血。3～8周龄的鸡感染常突然死亡，初期诊断较为困难，一般无明显的临床症状，通常发病7天后，死亡率逐渐上升。FAdV
‑
4给我国乃至全球的家禽养殖业带来巨大的经济损失，已成为威胁我国养禽业的重大疫病之一。但是目前仍然没有可用于畜牧兽医生产一线的能够快速、准确、简便、灵敏的诊断FAdV
‑
4的技术。
[0003]重组酶介导扩增法（Recombinase aided amplification，RAA），其利用DNA聚合酶、重组酶、单链结合蛋白在恒温条件下进行核酸扩增，仅需要在37℃左右反应 30min
‑
60min，即能得到与PCR 相同的结果。该方法弥补了PCR检测需要高温和贵重仪器的缺点，用时少、操作简易，只需一个恒温装置即可。由于不受仪器的限制，可以对大量样品进行快速检测，具有现场快速诊断的优越性。
[0004]因此，本专利技术设计并筛选了一对针对FAdV
‑
4的特异性引物，通过重组酶介导的等温扩增方法建立了一种快速、准确、简便、灵敏的诊断FAdV
‑
4的技术，其与PCR的符合率达100%。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对养鸡场现场准确、快速检测FAdV
‑
4难的问题，提供一种FAdV
‑
4 NP株特异性引物及其在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用。本专利技术所建立的RAA诊断技术具有特异性和敏感性好，重复性高，快速、准确等优点。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种FAdV
‑
4 NP株特异性引物，其核酸序列如下：FAdV
‑4‑
ORF19A F3:5'
‑
ACCTCAGAACCAACTACTGCTGCTACTAC
‑
3';FAdV
‑4‑
ORF19A R3:5'
‑
ATGAATACGGCAATGATAACACTGAGACAGAC
‑
3'。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供一种FAdV
‑
4 NP株特异性引物在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用，其应用方法包括以下步骤：（1）FAdV
‑
4 NP株病毒DNA提取；（2）RAA反应检测禽腺病毒血清4型：
反应体系：ddH2O15.5μL，缓冲液25μL，10μmol/L的FAdV
‑4‑
ORF19AF3/FAdV
‑4‑
ORF19AR3引物各2μL，DNA模板3μL，280mmol/L的乙酸镁2.5μL；所有成分除乙酸镁外全部同时加入预先冻干有SSB800ng/μL，uvsX120ng/μL，DNA聚合酶30ng/μL0.2mL的反应管；反应条件：以上反应体系混合均匀，在35
‑
43℃温度条件下恒温反应30~50min。
[0008]进一步的，上述应用方法中，反应条件为以上反应体系混合均匀，在37℃温度条件下恒温反应40min。
[0009]本专利技术的有益效果在于：采用所设计的特异性引物，并应用于重组酶介导等温核酸扩增（RAA）快速诊断技术，反应温度37℃，反应时间只需40min就可以准确诊断FAdV
‑
4。最低检测模板浓度为0.1ng/μL，灵敏性好。以禽白血病病毒（ALV）、番鸭呼肠孤病毒（ARV）、禽流感病毒H9亚型(H9AIV)、鸡坦布苏病毒（TMUV）、新城疫病毒(NDV)以及FAdV
‑
4基因组DNA为模板进行RAA扩增，只有FAdV
‑
4有目的条带被扩增，RAA特异性强；批间和批内RAA反应结果条带的亮度一致，所建立的RAA重复性好。本专利技术的引用用于检测粪便样品，减少了临床采血对鸡的应激，减少了工作量。
附图说明
[0010]图1RAA引物筛选结果。M:DNAMaker；1
‑
9分别为FAdV
‑4‑
ORF19AF1/R1、FAdV
‑4‑
ORF19AF1/R2、FAdV
‑4‑
ORF19AF1/R3、FAdV
‑4‑
ORF19AF2/R1、FAdV
‑4‑
ORF19AF2/R2、FAdV
‑4‑
ORF19AF2/R3、FAdV
‑4‑
ORF19AF3/R1、FAdV
‑4‑
ORF19AF3/R2、FAdV
‑4‑
ORF19AF3/R3引物RAA扩增。
[0011]图2RAA不同反应温度反应结果。M:DNA标志物，1
‑
5分别为33℃，35℃、37℃、39℃、41℃下的RAA扩增产物，N为阴性对照。
[0012]图3不同反应时间RAA扩增产物。M：DNA标志物；1
‑
5分别为RAA37℃扩增10、20、30、40、50min的产物；N阴性对照。
[0013]图4RAA特异性实验结果。M:DNA标志物，泳道1
‑
6分别为FAdV
‑
4、AVL、ARV、H9AIV、NDV、CIAV，N为阴性对照。
[0014]图5RAA灵敏度检测结果。M：DNA标志物，泳道1
‑
6分别为FAdV
‑
4基因组浓度为10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001ng/μL的模板的RAA结果，N为阴性对照。
[0015]图6以重组质粒为模板RAA灵敏度检测结果。M：DNA标志物，泳道1
‑
6分别为模板质粒浓度分别为105、104、103、102、101、100copies/μL的模板的RAA结果，N为阴性对照。
[0016]图7重复性试验结果。A：批内重复结果；B：批间重复结果；N为阴性对照。
[0017]图8临床样本RAA与PCR检测结果。M：DNA标志物；A：RAA检测；B：PCR检测。
具体实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种FAdV
‑
4 NP株特异性引物，其特征在于：所述FAdV
‑
4 NP株特异性引物的核酸序列如下：FAdV
‑4‑
ORF19A F3:5'
‑
ACCTCAGAACCAACTACTGCTGCTACTAC
‑
3';FAdV
‑4‑
ORF19A R3:5'
‑
ATGAATACGGCAATGATAACACTGAGACAGAC
‑
3'。2.权利要求所述一种FAdV
‑
4 NP株特异性引物在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：（1）FAdV
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：王全溪，陆芍华，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：