一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2的荧光RT-PCR试剂及方法技术

本发明专利技术提供一种用于检测和区分甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS

【技术实现步骤摘要】
一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2的荧光RT-PCR试剂及方法


[0001]本专利技术涉及病原微生物检测技术，具体涉及甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2的核酸检测。

技术介绍

[0002]呼吸道感染是人类最常见的一类疾病，是引起人群发病和死亡的最主要原因之一。研究表明，呼吸道病毒是引起呼吸道疾病的最常见的病原体。呼吸道病毒包括流感病毒、冠状病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒等。呼吸道病毒感染引起的临床表现都较为相似，主要有鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎、气管炎、支气管炎、肺炎、咳嗽、呼吸困难、发烧、乏力等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。
[0003]流感病毒是引起流行性感冒的病原体。流感病毒属正粘病毒科，分为甲型、乙型、丙型和2016年首次发现的丁型。流感病毒的基因组由七或八条负链RNA 节段构成，每条RNA编码一或两个蛋白。其中甲型流感病毒根据病毒颗粒外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同，可分为16个H亚型(H1-H16) 和9个N亚型(N1-N9)，由于编码HA和NA的核苷酸序列容易发生突变，令HA 和NA的抗原表位发生改变，致使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模的流行。乙型流感病毒主要分成Victoria系与Yamagata系，抗原变异较小，可引起流感的局部爆发。丙型极少引起流行，丁型暂未见流行报道。在医疗卫生领域，对甲型和乙型流感病毒的诊断和监测最为重要。/>[0004]冠状病毒是另一大类重要的呼吸道病毒。冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科，可分为α、β、γ、δ四个属，基因组均由线性单股正链的RNA组成。目前已发现7种可感染人类的冠状病毒，即α属的HCoV-229E和HCoV-NL63，以及β属的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2。其中 SARS-CoV-2是引发当前新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情的病原体，与蝙蝠类SARS冠状病毒(Bat SARS-like coronavirus)和SARS-CoV有最接近的亲缘关系。COVID-19能引起和流行性感冒相似的肺炎、咳嗽、发烧、乏力等症状，所以在临床诊断和疫情防控上，区别SARS-CoV-2和流感病毒具有重要意义。
[0005]荧光RT-PCR技术以特定的呼吸道病毒基因序列为检测目标，对来源于人体样本中的呼吸道病毒核酸进行体外定性检测。荧光RT-PCR因其准确、灵敏、快速等特点，已被越来越多地应用于临床上辅助诊断呼吸道病毒感染相关疾病，是目前COVID-19主要确诊方法。但是，常规荧光RT-PCR检测试剂均为液体试剂，需要在-20℃以下保存才能保持检测活性，保存、运输和使用过程中的温度升高、反复冻融都会降低试剂的检测性能。特别是在疫情期间交通运输受阻，冷链运输条件难以保障，长途运输时试剂失效的风险及冷链管理成本大大增加，不能适应国际长途运输及冷链条件较差的基层检测机构的应用。
[0006]此外，由于全球疫情爆发，不同地区分别进入冬季流行性感冒季节，由于流感与COVID-19的早期症状相似，给疫情控制带来更大的挑战。市场急需一种能准确检测和区分
流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2的荧光RT-PCR检测试剂。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是：提供一种可准确检测和区分甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2，且无需冷链的多重荧光RT-PCR检测试剂及方法。
[0008]本专利技术所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：
[0009]1.引物、探针的设计
[0010]本专利技术所述的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒SARS-CoV-2荧光 RT-PCR检测试剂所用的引物探针是基于公众基因序列数据库最新的甲型流感病毒、乙型流感病毒和SARS-CoV-2的核酸信息设计、筛选而得出。优选地，试剂中可添加人RNase P的特异引物探针，作为检测的内标。引物探针的序列如下：
[0011]检测甲型流感病毒的特异性正向引物的序列为5
’-
CATGGARTGGCTAAAGACAAG ACC-3
’
(即SEQ ID No.1)，反向引物的序列为5
’-
CATTTTGGACAAAGCGTCTACG
ꢀ-3’
(即SEQ ID No.2)，探针的序列为5
’-
CAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3
’
(即 SEQ ID No.3)。该引物、探针的序列在已知甲型流感病毒的核酸序列中高度保守，且对其它物种具有排他性。
[0012]检测乙型流感病毒的两条特异正向引物的序列为5
’-
TTCGAGCGTCTTAATGAA GGACA-3
’
(即SEQ ID No.4)和5
’-
CGAGCGTCTCAATGAAGGACA-3
’
(即SEQ IDNo.5)(两条正向引物是针对该位置的单核苷酸多态性而设计，可按一定比例混合后使用)，反向引物的序列为5
’-
TGGTGATAATCGGTGCTCTTGAC-3
’
(即SEQ ID No.6)，探针的序列为5
’-
CAAAGCCAATTCGAGCAGCTGAAACTG-3
’
(即SEQ ID No. 7)。该引物、探针的序列在已知乙型流感病毒核酸序列中高度保守，且对其它物种具有排他性。
[0013]检测冠状病毒SARS-CoV-2的特异正向引物的序列为5
’-
TGCAGTCATAACAAGA GAAGTGGGT-3
’
(即SEQ ID No.8)，反向引物的序列为5
’-
CAAAAAGTCACCATTA GTTGTGCG-3
’
(即SEQ ID No.9)，探针的序列为5
’-
TTGTCGTGCCTGGTTTGCCTG G-3
’
(即SEQ ID No.10)。所述的引物、探针的核酸序列在已知SARS-CoV-2 核酸序列中高度保守，且对最近缘的Bat SARS-like coronavirus和SARS-CoV 的核酸序列具有排他性。
[0014]内标人RNase P的特异正向引物的序列为5
’-
CTGCGAGCGGGTTCTGAC-3
’
(即 SEQ ID No.11)，反向引物的序列为5
’-
AACGATATGATTGATAGCAACAACTGA-3
’
(即 SEQ ID No.12)，探针的序列为5
’-
AAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGA-3
’
(即SEQ IDNo本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2的多重荧光RT-PCR试剂，其特征在于，为冻干型试剂，包含了荧光RT-PCR除样本核酸外所有必需的组份，由Tris-HCl缓冲液、氯化钾、氯化镁、dNTPs、Taq DNA聚合酶、逆转录酶、冻干赋形剂及检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2的特异性引物和探针通过真空冷冻干燥的方法制成。2.权利要求1中所述的检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2的多重荧光RT-PCR试剂，其特征在于，所述的检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2的特异性引物及探针序列如下：检测甲型流感病毒的正向引物序列为SEQ ID No.1，反向引物序列为SEQ ID No.2，探针序列为SEQ ID No.3；检测乙型流感病毒的正向引物序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，反向引物序列为SEQ ID No.6，探针序列为SEQ ID No.7；检测冠状病毒SARS-CoV-2的正向引物序列为SEQ ID No.8，反向引物序列为SEQ ID No.9，探针序列为SEQ ID No.10；所述的检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2的探针的5
’
端用荧光报告基团修饰，3
’
端用荧光淬灭基团修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎绍基，林镜中，刘钰涵，朱碧莹，黄俊辉，
申请(专利权)人：深圳市赛格诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：