鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒及伪狂犬病毒的四重PCR引物组制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒及伪狂犬病毒的四重PCR引物组，属于兽用医疗制品技术领域。使用本发明专利技术的引物组可同时检测水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒及水貂伪狂犬病毒。本发明专利技术还公开了含有上述引物组的试剂盒并建立了相关的多重PCR检测方法。本发明专利技术建立的多重PCR检测方法简单，检测速度快且批量大、特异性好、准确性高、重复性好，可以准确、快速、高通量的进行临床样本的检测，也可应用于宠物犬、雪貂及狐狸、貉病毒病的检测。貉病毒病的检测。

【技术实现步骤摘要】
鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒及伪狂犬病毒的四重PCR引物组


[0001]本专利技术涉及一种鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒、伪狂犬病毒的四重PCR引物组，还涉及含有该引物组的试剂盒及其应用，本专利技术属于兽用医疗制品


技术介绍

[0002]我国毛皮动物养殖业从上世纪50年代起步，90年代获得蓬勃发展，如今已成为畜牧业养殖的重要组成部分。目前，我国水貂存栏数可达5000万只，主要集中在山东、河北、吉林、辽宁、黑龙江、内蒙古等省份地区，并形成了较大的产业链。在某些地区水貂等毛皮动物养殖业甚至成为区域经济的支柱性产业。可见毛皮动物养殖业对推动“三农”经济发展，促进农村产业结构调整，增加农民就业和收入起到了重要的作用。因此，及时对上述四种疾病进行防控能够最大限度的减少上述传染病发生给水貂养殖业带来的损失，促进水貂养殖业的发展。
[0003]水貂犬瘟热是由副黏病毒科麻疹病毒属犬瘟热病毒引起的急性、热性、高度接触性传染病，其主要特征是以侵害黏膜系统为主，出现双相体温升高，伴有卡他性肺炎、胃肠炎，偶有神经症状，容易继发其他细菌病毒的混合感染和二次感染，幼貂死亡率可高达80％。带毒水貂是最危险的传染源，通过眼及鼻分泌物、唾液、尿、粪便排出病毒，主要经消化道、呼吸道传染，是水貂养殖业三大疫病之一，俗称“貂瘟”。
[0004]水貂细小病毒性肠炎是由细小病毒科细小病毒属水貂细小病毒引起的急性、高度接触性传染病，是水貂养殖业三大疫病之一。不同年龄和品种的水貂均有易感性，但50～60日龄的仔貂和幼貂最为易感，幼貂的发病率为70％以上，其死亡率可达90％；成年貂的发病率为30％左右，死亡率在30％以下。患病水貂和耐过貂是该病的主要传染源，通过粪、尿、唾液排毒，经消化道和呼吸道传染给易感染的健康貂。该病全年都可发生，常呈地方性流行，一旦传入貂场，如兽医防疫卫生措施不完善，常常导致该病长期存在和周期性发生。
[0005]水貂阿留申病又称水貂浆细胞增多症(Plasmacytosis)，是农业部动物疫病病种名录中三类动物疫病、中国-丹麦进境水貂议定书中的必检疫病项目，该病由水貂阿留申病毒引起的，它可以感染任何年龄段的水貂，并且病症呈现出多样的表现形式。对患急性肺炎的新生仔貂而言，阿留申病毒几乎可以导致其100％的死亡率；而对成年水貂，该病通常引起水貂的持续感染，并表现为终生病毒血症、高蛋白血症、动脉血管炎和由病毒-抗体复合体诱导的肾小球肾炎和肝炎等。
[0006]水貂犬瘟热、水貂细小病毒性肠炎、水貂阿留申病是水貂常见传染病。其中水貂阿留申病毒感染范围广，常呈隐形感染，造成水貂消瘦、皮张毛色不佳，短小不光滑。而水貂细小病毒、犬瘟热病毒发病率高、死亡率高，对养貂业造成严重损失。近年来，从水貂体内又分离出貂源伪狂犬病毒。伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的经济动物和家畜的一种急性传染病。其特征是发热、奇痒、内脏出血、脑脊髓炎等，近年来水貂临床病例持续增加。
[0007]上述四种水貂疾病临床某些症状相似，又容易混淆或者混合感染。临床鉴别诊断困难，常用单一PCR检测方法耗时耗力，所以，建立一种同时检测四种疾病的鉴别诊断方法具有重要的实际意义和推广前景。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的之一在于提供一种用于鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒、貂源伪狂犬病毒的四重PCR引物组。
[0009]本专利技术的目的之二在于提供一种含有上述的四重PCR引物组的试剂盒及其在鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒、伪狂犬病毒中的应用。
[0010]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
[0011]本专利技术的一种鉴别水貂犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)、水貂细小病毒(又称水貂肠炎病毒，Mink Enteritis Virus，MEV)、水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus，AMDV)以及伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)的四重PCR引物组，所述的引物组由分别用于扩增水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒以及伪狂犬病毒基因组片段的四对引物组成，其核苷酸序列如下所示：
[0012]CDV1：5
’-
GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3
’
；
[0013]CDV2：5
’-
CTTGAGCTTTCGACCCTTC-3
’
；
[0014]MEV1:5
’-
CAGGTGATGAATTTGCTACAGGAAC-3
’
；
[0015]MEV2:5
’-
ACAAATGGTGCATTTACATGAAGTC-3
’
；
[0016]ADV1：5
’-
CACTGGGCTTTGTTCCTT-3
’
；
[0017]ADV2：5
’-
TTACCTCTTTCCTCACCC-3
’
；
[0018]PRV1：5
’-
GTTCGTGCGCTACTCCTCCGC-3
’
；
[0019]PRV2：5
’-
AGGTCGACCACGGTGCCGTT-3
’
。
[0020]进一步的，本专利技术还提出了所述的四重PCR引物组在制备检测水貂、貉或狐来源的CDV、MEV、AMDV及PRV试剂中的应用。
[0021]更进一步的。本专利技术还提出了一种鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒以及伪狂犬病毒的四重PCR检测试剂盒，该试剂盒包含本专利技术所述的四重PCR引物组。
[0022]其中，优选的，所述的试剂盒中还含有2
×
Ex Taq Buffer，one step enzyme mix以及无核酸酶水。
[0023]其中，优选的，所述的四重PCR检测试剂盒PCR反应体系为：2
×
Ex Taq Buffer 15μL，所述的引物CDV1、CDV2、MEV1、MEV2、ADV1、ADV2、PRV1、PRV2各0.5μL，核酸模板2μL，余量用无RNA酶灭菌水补足至30μL。
[0024]其中，优选的，所述的四重PCR检测试剂盒的PCR反应程序为：45℃，30min；95℃预变性3min；94℃40s，54℃30s，72℃30s，共计34个循环；最后72℃延伸7min。
[0025]再进一步的，本专利技术还提出了一种鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒以及伪狂犬病毒的四重PCR检测方法，包括下列步骤：
[0026]1)使用商品化的病毒DNA/RNA提取试剂盒从样品中提取核酸；
[0027]2)以提取的核酸为模板，用本专利技术所述的引物组进行PCR扩增反应，获得扩增产
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别水貂犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)、水貂细小病毒(又称水貂肠炎病毒，Mink Enteritis Virus，MEV)、水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus，AMDV)以及伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)的四重PCR引物组，所述的引物组由分别用于扩增水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒以及伪狂犬病毒基因组片段的四对引物组成，其核苷酸序列如下所示：CDV1：5
’-
GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3
’
；CDV2：5
’-
CTTGAGCTTTCGACCCTTC-3
’
；MEV1:5
’-
CAGGTGATGAATTTGCTACAGGAAC-3
’
；MEV2:5
’-
ACAAATGGTGCATTTACATGAAGTC-3
’
；ADV1：5
’-
CACTGGGCTTTGTTCCTT-3
’
；ADV2：5
’-
TTACCTCTTTCCTCACCC-3
’
；PRV1：5
’-
GTTCGTGCGCTACTCCTCCGC-3
’
；PRV2：5
’-
AGGTCGACCACGGTGCCGTT-3
’
。2.权利要求1所述的四重PCR引物组在制备检测水貂、貉或狐来源的CDV、MEV、AMDV及PRV试剂中的应用。3.一种鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒以及伪狂犬病毒的四重PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海玲，白雪，廉士珍，胡博，张蕾，李伟，张东亮，李虹晔，李双双，李紫仟，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：