本发明专利技术公开一种用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒。通过将猫细小病毒NS1基因序列和猫艾滋病毒pol基因序列进行比对后，发现二者基因序列无交叉，同源性较低。因此根据二者序列设计特异性的探针和引物，通过荧光定量PCR扩增对猫细小病毒和猫艾滋病毒进行诊断。并且将该引物和探针制备成试剂盒用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒。本发明专利技术全程只需要2h左右，时间较短，并且该试剂盒操作简单，灵敏度高，特异性较好，并且能同时检测到猫细小病毒和猫艾滋病毒，能避免对其中一种病毒检测的遗漏。能避免对其中一种病毒检测的遗漏。能避免对其中一种病毒检测的遗漏。
【技术实现步骤摘要】
一种用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒
[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒。
技术介绍
[0002]猫细小病毒又被称为猫泛白细胞减少症病毒、猫瘟病毒或猫传染性肠炎病毒，主要以高热、呕吐、白细胞严重减少和肠炎为特征，是危害猫科动物的主要疾病之一。1982年欧美科学家发现猫细小病毒，并于1957年Bilin首次分离出该病毒，随后于1964年Johnson从一头疑似患有猫传染性肠炎症状的豹脾脏中同样分离出了该病毒。猫细小病毒主要侵染胃肠道组织的黏膜上皮细胞，造成细胞的病变和死亡，由该病毒引起的猫泛白细胞减少症的临床表现有多种，可分为特急性型、急性型、亚急性型和不显性型。特急性型为突然死亡，无临床症状；急性型为24h内死亡；亚急性型在一周左右死亡，伴随发热、呕吐、厌食和脱水等症状。通过一系列病原学研究，证明了猫细小病毒在自然条件下容易感染猫科和鼬科等多种动物，其中水貂最为易感。由猫细小病毒引起的猫泛白细胞传染症现今在世界各地均有分布。目前，针对猫细小病毒的预防主要是疫苗的接种，包括灭活病毒疫苗和减毒活疫苗。其中，灭活病毒疫苗的安全性较高，但是不如减毒活疫苗的临床效果好。针对预防该病毒的疫苗在欧洲的一些国家已商品化，但是针对该病毒的诊断试剂却参差不齐。因此，建立一种快速、准确的用于检测猫细小病毒的方法显得尤为重要。
[0003]猫艾滋病毒属于属反转录病毒，慢病毒。1987年，该病毒在美国加利福尼亚首次从免疫力低下的猫中被分离。其具有严格的宿主性，只感染猫，并经由咬伤而感染。该病毒的感染阶段包括急性期、无症状带毒期、持续性淋巴腺病、艾滋病相关复合症和FAIDS阶段。FIV可以感染CD4+、CD8+、T细胞、B细胞和巨噬细胞，自从1985年以来，在世界范围内较为流行且具有较强的突变性。针对其治疗方式，目前无有效疫苗，主要是控制继发感染和缓解临床症状。因此，建立一种快速准确检测猫艾滋病毒的方法尤为重要，可为临床诊断和治疗提供技术支持。
技术实现思路
[0004]本专利技术目的是在于针对现有技术的不足，提供一种同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR引物、探针和试剂盒。通过将猫细小病毒NS1基因序列和猫艾滋病毒pol基因序列进行比对后，发现二者基因序列无交叉，同源性较低。因此根据二者序列设计特异性的探针和引物，通过荧光定量PCR扩增对猫细小病毒和猫艾滋病毒进行诊断。并且将该引物和探针制备成试剂盒用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒。
[0005]本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测引物组，包括上游引物和下游引物。
[0007]针对猫细小病毒的荧光定量PCR检测上游引物和下游引物，序列分别如下：
[0008]上游引物：5
’-
GGCAAGCAATCCTCAGAGTC-3
’
，如SEQ ID NO.1所示；
[0009]下游引物：5
’-
GAGTACTCCACGGTTCCAGT-3
’
，如SEQ ID NO.2所示；
[0010]针对猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测上游引物和下游引物，序列如下：
[0011]上游引物：5
’-
ACATTCCAGAACAGCCCACT-3
’
，如SEQ ID NO.3所示；
[0012]上游引物：5
’-
TGTACTTCCAGTCGAGCTTCT-3
’
，如SEQ ID NO.4所示；
[0013]第二方面，本专利技术提供了一种猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测探针，其序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
[0014]针对猫细小病毒的荧光定量PCR检测探针，序列如下：
[0015]5’-
HEX-ACTCCGGACGTAGTGGACCTTGC-BHQ-3
’
，如SEQ ID NO.5所示；
[0016]针对猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测探针，序列如下：
[0017]5’-
FAM-TGGGCTAGCCAAGCTATTCCAGACTTG-TAMRA-3
’
，如SEQ ID NO.6所示；
[0018]优选地，所述探针5
’
端结合荧光报告基团，3
’
端结合荧光淬灭基团，所用于检测猫细小病毒的探针其荧光报告基团类型为HEX，荧光淬灭基团类型为BHQ，所用于检测猫艾滋病毒的探针其荧光报告基团类型为FAM，荧光淬灭基团类型为TAMRA。
[0019]在qPCR扩增过程中，当探针完整时，其荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；当扩增开始时，在Taq酶的5'-3'外切酶的作用下，探针被酶切降解，荧光基团和淬灭基团分离开来，因此荧光监测系统可以检测到荧光信号。荧光定量PCR仪根据接收的荧光信号扩增曲线，从而对猫细小病毒和猫艾滋病毒的核酸进行检测来诊断疾病。根据是否出现S型扩增曲线实现定性检测，其次根据不同稀释级标准品的Ct值和浓度绘制标准曲线，以样本Ct值计算出样本浓度实现定量检测。
[0020]第三方面，本专利技术提供了一种用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括以上序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物和如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的探针。
[0021]一种同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量试剂盒还包括2
×
Premix ExTaq Probe qPCR、阳性对照和阴性对照；其中2
×
Premix ExTaq Probe qPCR包括Takara Ex TaqHS、Mg
2+
、dNTP Mixture和Tli RNaseH；阳性对照为含猫细小病毒和猫艾滋病毒目的基因扩增序列的质粒；阴性对照为ddH2O。
[0022]除此之外，所述的荧光定量检测试剂盒还包括核酸提取试剂；其中核酸提取试剂包括Proteinase K、BufferAL、BufferAW1、BufferAW2和BufferAE。
[0023]第四方面，本专利技术提供了一种非诊断目的的用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测方法，主要操作步骤包括：核酸提取和qPCR扩增。
[0024](1)核酸提取：使用QIAamp DNAMini Kit提取DNA；具体操作步骤为：
[0025]样品中依次加入20μL蛋白酶K、200μL缓冲液AL，涡旋振荡15s混匀；70℃孵育10min，离心后加入200μL无水乙醇，漩涡15s后离心，将上清液加入到含有QIAamp Min本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测引物，其特征在于：针对猫细小病毒的荧光定量PCR检测上游引物和下游引物，序列分别如下：上游引物：5
’-
GGCAAGCAATCCTCAGAGTC-3
’
，如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5
’-
GAGTACTCCACGGTTCCAGT-3
’
，如SEQ ID NO.2所示；针对猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测上游引物和下游引物，序列如下：上游引物：5
’-
ACATTCCAGAACAGCCCACT-3
’
，如SEQ ID NO.3所示；上游引物：5
’-
TGTACTTCCAGTCGAGCTTCT-3
’
，如SEQ ID NO.4所示。2.一种猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测探针，其特征在于：针对猫细小病毒的荧光定量PCR检测探针，序列如下：5
’-
HEX-ACTCCGGACGTAGTGGACCTTGC-BHQ-3
’
，如SEQ ID NO.5所示；针对猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测探针，序列如下：5
’-
FAM-TGGGCTAGCCAAGCTATTCCAGACTTG-TAMRA-3
’
，如SEQ ID NO.6所示。3.如权利要求2所述的探针，其特征在于探针5
’
端结合荧光报告基团，3
’
端结合荧光淬灭基团，所用于检测猫细小病毒的探针其荧光报告基团类型为HEX，荧光淬灭基团类型为BHQ，所用于检测猫艾滋病毒的探针其荧光报告基团类型为FAM，荧光淬灭基团类型为TAMRA。4.一种用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物和如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的探针。5...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭佳花，孙晓笛，陆维克，陈金树，
申请(专利权)人：杭州奥泰生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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