一种蓝舌病病毒血清型鉴定的RT-qPCR检测试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)血清型鉴定的RT

【技术实现步骤摘要】
一种蓝舌病病毒血清型鉴定的RT-qPCR检测试剂盒和方法


[0001]本专利技术属于兽医传染病检测
，具体地，涉及一种蓝舌病病毒血清型鉴定的RT-qPCR检测试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)感染引起的蓝舌病(Bluetongue，BT)是一种严重侵害反刍动物的烈性出血性虫媒病毒病。BT的暴发可给牛羊养殖业带来巨大的经济损失，被世界动物卫生组织(Office international des epizooties,OIE)列为法定报告的动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。BTV主要通过库蠓(Culicoides spp.)的叮咬传播，可感染大多数家养和野生反刍动物。牛和山羊感染BTV后，往往呈隐性感染，成为病毒重要的储存宿主与传染源。BTV感染绵羊可引起明显的BT临床症状，主要表现为高热、消瘦、口唇充血肿胀及糜烂、鼻腔和胃肠黏膜出血溃疡、蹄冠脱落引起跛行等症状。BT疫情暴发时，感染绵羊的发病率可达80％，死亡率可高达40％，给牛羊养殖业带来毁灭性损失。
[0003]BTV隶属呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)，目前世界范围已发现27种血清型的BTV(BTV-1至BTV-27)。病毒的基因组大小约20kb，由10个节段(Seg-1～Seg-10)的双链RNA(Double stranded RNA，dsRNA)组成，可编码7种结构蛋白(VP1-VP7)与5种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3a与NS4)。Seg-2编码的VP2蛋白是构成病毒外层衣壳的主要蛋白，可诱导感染动物产生特异性中和抗体，决定着BTV的血清型。Seg-2/VP2具有高度变异的特性，序列分析显示不同血清型BTV毒株的Seg-2核酸序列差异度在38.6％～59.5％之间，VP2蛋白氨基酸序列差异度在40.5％～70.9％之间；同一种血清型BTV毒株之间Seg-2/VP2的序列差异度也可达31.6％/27.4％，在系统发生树上可将同一种血清型BTV的Seg-2分为“Eastern”(东方)和“Western”(西方)两种地域型。
[0004]2012年以来，专利申请人在我国云南省、广东省、广西壮族自治区、江苏省、湖南省、山西省、新疆维吾尔族自治区与内蒙古自治区开展了全国范围的BTV流行病血调查研究，分离出12种血清型(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21、-24型)的BTV共计300余株。对我国流行的不同血清型BTV毒株Seg-2基因序列分析表明，我国流行的BTV-1、-2、-3、-4、-9、-16与-21等七种血清型BTV的Seg-2与日本和澳大利流行毒株具有最近的亲缘关系，核酸序列相似度>94％，均属于Eastern型；而我国流行的BTV-5、-7与-24的Seg-2与南非毒株具有最近的亲缘关系，核酸序列相似度>92％，属于Western型。多种血清型BTV在我国的广泛流行，给我国BT的防控带来了严峻挑战。建立特异性强、灵敏度高、可进行高通量检测的BTV血清型检测技术，是开展我国BTV流行病学研究，进而制定BTV科学防控策略的前提。
[0005]血清中和试验是BTV血清型鉴定的传统方法，存在耗时、费力与实验成本高等方面的不足。常规RT-PCR是病毒核酸检测广泛使用的方法，具有简便快捷的优点，但是该方法灵敏度较差，主要适用于分离病毒的检测，难以有效对病原核酸含量低的临床样本进行检测。

技术实现思路

[0006]针对现有血清中和试验和常规RT-PCR等检测技术在BTV血清型检测中存在耗时长、成本高、检测通量小与灵敏度较低等缺陷，本专利技术的目的是提供针对中国流行的12种血清型BTV的实时荧光定量RT-PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测试剂盒及对应的方法，以实现对中国流行BTV毒株血清型的快速准确鉴定。该试剂盒具有操作简便、花费时间少、成本低廉、检测结果准确等优势，填补了国内尚无BTV血清型的RT-qPCR快速检测试剂盒的空白。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]1.蓝舌病病毒血清型鉴定的RT-qPCR试剂盒
[0008]本专利技术根据我国已发现的12种血清型BTV(BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24型)毒株的基因节段2(Segment 2,Seg-2)序列特性，根据每种血清型Seg-2序列高度保守区域设计出12套BTV血清型特异性RT-qPCR引物及其相应的探针组合，引物及对应的探针序列如表1所示。
[0009]表1中国流行的12种血清型BTV特异性RT-qPCR鉴定引物及探针信息
[0010][0011][0012]进一步，优选的是，所述试剂盒中特异性检测12种血清型BTV毒株Seg-2基因扩增
片段的探针，5'端标记荧光发生基团(报告基团)的6-羧基荧光素报告荧光基团(6-carboxy-fluorescein,FAM)，3'端标记荧光淬灭(抑制基团)的黑洞淬灭基团1(black hole quencher 1,BHQ1)。
[0013]本专利技术还提供了含有所述引物和探针的用于检测中国流行BTV毒株血清型的RT-qPCR试剂盒。
[0014]进一步，优选的是，所述BTV血清型RT-qPCR试剂盒检测的样品为细胞培养物或动物血液中的BTV核酸。
[0015]进一步，优选的是，所述BTV血清型RT-qPCR试剂盒还包括RT-qPCR缓冲液、50
×
ROX Reference DyeⅡ、dNTPs、RNA酶抑制剂、逆转录酶和DNA聚合酶的一种或多种。
[0016]进一步，优选的是，所述BTV血清型RT-qPCR检测试剂盒，还包括标准阳性对照样品、标准阴性对照样品、无RNA酶的去离子水。
[0017]进一步，优选的是，所述标准阳性对照样品为确定核酸拷贝数的12种血清型(BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24型)BTV毒株的核酸样本，所述12种血清型BTV毒株的核酸样本的核酸拷贝数如表2所示。
[0018]表2 12种血清型BTV毒株的核酸样本的核酸拷贝数
[0019][0020]进一步，优选的是，在一些实施方案中所述标准阴性对照为提取的正常培养的BHK-21细胞总RNA。
[0021]进一步，优选的是，在一些实施方案中所述标准阴性对照为未被BTV感染的新生犊牛血液RNA。
[0022]用于所述BTV血清型RT-qPCR试剂盒的反应体系为：2
×
One Step RT-PCR BufferⅢ10.0μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于特异性扩增12种血清型BTV毒株Seg-2基因序列的引物对及探针组合，所述的12种血清型BTV毒株为：BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24；所述引物对及探针组合包括：用于特异性扩增BTV-1型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，能够特异性检测相应扩增片段的探针具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-2型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，能够特异性检测相应扩增片段的探针具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-3型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，能够特异性检测相应扩增片段的探针具有SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-4型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的核苷酸序列，能够特异性检测相应扩增片段的探针具有SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-5型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的核苷酸序列，能够特异性检测相应扩增片段的探针具有SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-7型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示的核苷酸序列，能够特异性检测相应扩增片段的探针具有SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-9型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的核苷酸序列，能够特异性检测相应扩增片段的探针具有SEQ ID No.21所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-12型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示的核苷酸序列，能够特异性检测相应扩增片段的探针具有SEQ ID No.24所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-15型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示的核苷酸序列，能够特异性检测相应扩增片段的探针具有SEQ ID No.27所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-16型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.28和SEQ ID No.29所示的核苷酸序列，能够特异性检测相应扩增片段的探针具有SEQ ID No.30所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-21型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示的核苷酸序列，能够特异性检测相应扩增片段的探针具有SEQ ID No.33所示的核苷酸序列；用于特异性扩增BTV-24型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖德芳，杨恒，李占鸿，宋子昂，李卓然，杨振兴，李华春，
申请(专利权)人：云南省畜牧兽医科学院，
类型：发明
国别省市：