验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用，涉及HBV耐药突变基因检测领域。该检测方法包括：环介导等温扩增；根据LAMP扩增产物设计三个探针；利用滚环扩增反应获得三维大体积DNA分子；P1偶联hCG信号分子作为信号探针，P1、P2和P3杂交后产生的三通探针与滚环扩增产物结合，产物中多个重复单元与P2末端杂交，固定信号探针使其无法进入验孕试纸，加入LAMP扩增产物使其与P2、P3杂交从而将信号探针置换出来进入验孕试纸显色，实现对HBV耐药突变基因的全均相信号开型POCT检测。本发明专利技术操作简便、成本低、无需复杂仪器、灵敏度高、特异性好。特异性好。特异性好。
【技术实现步骤摘要】
验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用
[0001]本专利技术涉及乙型肝炎病毒耐药突变基因检测
，具体涉及一种验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用。
技术介绍
[0002]乙型肝炎病毒(HBV)是引起传染性疾病乙型肝炎的主要原因，并可引发肝硬化和肝癌。目前，临床治疗乙肝应用最多的药物是核苷类似物，但长期服用抗病毒药物会诱导HBV基因产生耐药突变，严重影响治疗效果。HBV耐药突变基因检测的金标准是PCR产物直接测序法，此外常用的方法还包括实时荧光PCR法、焦磷酸测序法、基因芯片法和限制性片段长度多态性分析法。
[0003]现有HBV耐药突变基因的检测方法存在诸多弊端，比如测序技术操作繁琐、价格昂贵且耗时久；实时荧光PCR技术特异性差且需要专业仪器，无法实现现场式即时诊断；基因芯片法价格昂贵，步骤复杂；限制性片段长度多态性分析法虽然操作简便，但存在非特异性切割同源体现象，准确率低，易造成漏检、误判等情况。
技术实现思路
[0004]针对现有技术存在的不足，本专利技术提供一种验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用，具有操作简便、成本低廉、无需复杂仪器且灵敏度高、特异性好的优点。
[0005]本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0006]本专利技术提供一种验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用。
[0007]本专利技术利用验孕试纸实现对乙型肝炎病毒耐药突变基因的现场即时检测，该方法主要包括以下步骤：
[0008](1)以乙型肝炎病毒耐药突变基因位点rt180M处的序列为模板，设计LAMP引物；
[0009](2)利用模板序列和LAMP引物进行环介导等温扩增；
[0010](3)针对LAMP扩增产物中的一种单链DNA环序列设计三个探针，其序列分别为：
[0011]P1：5
’-
NH
2-TCGTGGATAGTACTGAAGGAGC-3
’
；
[0012]P2：5
’-
GAGCCATGAGAAACGGACTATCCACGACCATCGACACCAAGCA-3
’
；
[0013]P3：5
’-
GCTCCTTCAGTCCGTTTCTC-3
’
；
[0014](4)滚环扩增
[0015]配置反应试剂，包括：RCA模板、RCA引物、T4 DNA连接酶、dNTPs、phi29 DNA聚合酶，经滚环扩增反应获得三维大体积DNA分子；
[0016](5)在探针P1上偶联hCG信号分子，将探针P1、探针P2和探针P3杂交后产生三通探针，将三通探针与三维大体积DNA分子室温反应0.8～1.2h后，加入LAMP扩增产物室温放置25～35min；
[0017](6)将验孕试纸插入上述产物中，取出拍照。
[0018]作为优选的实施方式，步骤(1)中，所述LAMP引物包括外部引物对和内部引物对，其序列分别为：
[0019]外部引物对：
[0020]TCCTGCTCAAGGAACCTCTA；
[0021]AAACAGTGGGGGAAAGCC；
[0022]内部引物对：
[0023]GCCCAGGATGATGGGATGGGATGTTTCCCTCTTGTTGCTGT；
[0024]CGCAAGATTCCTATGGGAGGGGACCACTGAACAAATGGCACT。
[0025]作为优选的实施方式，步骤(1)中，模板序列为：
[0026]TGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGGGGGCCTCAGTCCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTCATGGGATATG。
[0027]作为优选的实施方式，步骤(2)中，环介导等温扩增的条件为：55～65℃下反应1～3h。
[0028]作为优选的实施方式，步骤(3)中，所述单链DNA环序列为：GCCTCAGTCCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACT。
[0029]作为优选的实施方式，步骤(4)中，所述三维大体积DNA分子是具有无数重复RCA模板互补序列的花型结构分子，其序列为：(TCTACTATATGACGGCGAAGATATCTATATTGCTTGGTGTCGATGGGTAA)
n
，n为正数。
[0030]作为优选的实施方式，步骤(4)中，所述RCA模板序列为：ATATAGTAGATTACCCATCGACACCAAGCAATATAGATATCTTCGCCGTC。
[0031]作为优选的实施方式，步骤(4)中，所述RCA引物序列为：TCTACTATATGACGGCGAAG。
[0032]作为优选的实施方式，步骤(4)中，滚环扩增的具体实现过程如下：
[0033]将RCA模板、RCA引物、T4 DNA连接酶和dNTPs混合，在室温下反应3h后，加入phi29 DNA聚合酶并在30℃下孵育48h，75℃反应10min，离心洗涤，获得三维大体积DNA分子。
[0034]本专利技术的有益效果是：
[0035]本专利技术设计了一组LAMP引物，主要用于扩增乙型肝炎病毒耐药突变基因rt180M位点，并根据LAMP扩增产物设计三通探针即信号探针P1(偶联hCG信号分子)、检测探针P2、P3，通过滚环扩增产物(三维大体积DNA分子)中的多个重复单元与探针P2的末端碱基互补配对，将三通探针固定在三维大体积DNA分子上，从而固定信号探针P1使其无法进入验孕试纸，呈现阴性；然后加入LAMP扩增产物，使其与探针P2、探针P3杂交，从而将信号探针P1置换出来进入验孕试纸显色，呈现阳性。
[0036]本专利技术利用验孕试纸灵敏检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)浓度的特性，无需分离步骤，实现验孕试纸对HBV耐药突变基因的全均相信号开型现场即时检测(POCT)。上述检测方法将RCA产物中的多个重复单元与探针P2杂交，充分降低了背景信号，灵敏度可达到
2copies/μL；将基因突变位点设计在三通探针的“立足点”上，有效地区本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)以乙型肝炎病毒耐药突变基因位点rt180M处的序列为模板，设计LAMP引物；(2)利用模板序列和LAMP引物进行环介导等温扩增；(3)针对LAMP扩增产物中的一种单链DNA环序列设计三个探针，其序列分别为：P1：5
’-
NH
2-TCGTGGATAGTACTGAAGGAGC-3
’
；P2：5
’-
GAGCCATGAGAAACGGACTATCCACGACCATCGACACCAAGCA-3
’
；P3：5
’-
GCTCCTTCAGTCCGTTTCTC-3
’
；(4)滚环扩增配置反应试剂，包括：RCA模板、RCA引物、T4 DNA连接酶、dNTPs、phi29 DNA聚合酶，经滚环扩增反应获得三维大体积DNA分子；(5)在探针P1上偶联hCG信号分子，将探针P1、探针P2和探针P3杂交后产生三通探针，将三通探针与三维大体积DNA分子室温反应0.8～1.2h后，加入LAMP扩增产物室温放置25～35min；(6)将验孕试纸插入上述产物中，取出拍照。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述LAMP引物包括外部引物对和内部引物对，其序列分别为：外部引物对：TCCTGCTCAAGGAACCTCTA；AAACAGTGGGGGAAAGCC；内部引物对：GCCCAGGATGATGGGATGGGATGTTTCCCTCTTGTTGCTGT；CGCAAGATTCCTATGGGAGGGGACCACTGAACAAATGGCACT。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，模板序列为：TGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGT...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜衍，齐丽娟，杨媚婷，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。