本发明专利技术公开了一种柑桔黄龙病和黄化脉明病病原物的PCR引物组合及检测方法，利用黄龙病病菌16s和黄化脉明病病毒外壳蛋白以及内参CtACT特异引物均可在稀释10000倍条件下的病叶模板中扩增生成840、748、447、325和120 bp特异性条带。本发明专利技术通过3条柑桔黄龙病病菌16s和3条柑桔黄化脉明病病毒外壳蛋白特异引物的设计，可同时检测病毒6个特异性位点，避免假阳性的产生；1对柑桔CtACT内参引物的使用，可以检测柑桔模板合成质量，避免假阴性的产生，整个检测过程可以在4个小时内完成，可在1%琼脂糖进行PCR结果检测，不需使用昂贵的荧光定量PCR仪，具有快速、经济、灵敏度高、稳定性强的特点。稳定性强的特点。稳定性强的特点。
【技术实现步骤摘要】
一种柑桔黄龙病和黄化脉明病病原物的PCR引物组合及检测方法
[0001]本专利技术涉及植物病害检测领域，具体涉及一种柑桔黄龙病病菌和黄化脉明病病毒的PCR引物组合及检测方法。
技术介绍
[0002]柑桔(Citrus reticulata Blanco.)又名宽皮橘，黄橘，营养丰富，色香味兼优，既可鲜食又可加工成以果汁为主的各种加工制品，广泛种植于北纬35
°
以南的区域。
[0003]柑桔易受多种病害的影响，其中以柑桔黄龙病和黄化脉明病病最为常见。
[0004]黄龙病是一种韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)引起的柑桔毁灭性病害，能够侵染包括柑橘属、枳属、金柑属和九里香等多种芸香科植物。柑桔木虱和带病苗木或带病接穗是远距离传病的主因，往往使无病的新区变成病区，而柑桔长期以来通过扦插或嫁接进行种苗繁育，极易造成大面积带病植株的传播，对于商业化种植来讲，通常在柑桔发现病害只能将整株植株直接销毁。
[0005]CYVCV是α-线性病毒科柑橘病毒属的新成员，虽然80%的植物病毒病依赖于媒介昆虫传播，但目前尚未发现介导该病毒在柑橘间进行传播的昆虫。该病一旦发生，可在短时间内迅速传播，主要传播方式是嫁接传播，且传毒效率较高，苗木带毒可实现远距离传播。因此，培育无CLas和CYVCV病苗、及早发现带CLas和CYVCV植株是防控柑桔CLas和CYVCV的关键。
[0006]虽然受CLas和CYVCV感染的柑桔植株可表现出明显特征，但并不排除表型良好的植株不含有CLas和CYVCV，染病植株需经过长短不一的潜伏期后才表现症状，待其症状明显时，防治难度及经济损失大。现阶段对带病植株材料的鉴定存在较大困难，检测柑桔是否感染黄龙病和黄化脉明病需分别提取待测样品DNA和RNA，检测过程复杂、效率低、检测成本高；并且，现有的检测技术，其检测结果出现假阳性和假阴性的概率很高。本方法利用PCR技术进行CLas和CYVCV检测，只需单独提取待测样品RNA进行检测，大大提高检测效率，缩短检测时间和检测成本；同时，对CLas和CYVCV特异性引物的设计进行双重检测，可排除假阳性产生，内参CtACT特异性引物的设计进行检测，能够排除检测结果出现假阴性的产生。目前，虽然对柑桔病害的检测研究甚多，但在柑桔上还未见可对CLas和CYVCV同时检测的相关报道。
技术实现思路
[0007]根据上述领域存在的不足，本专利技术提供用于检测柑桔CLas和CYVCV的引物组合和检测方法。本专利技术请求保护的技术方案如下：一种柑桔黄龙病菌黄龙病病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas)和黄化脉明病病毒（Citrus yellow vein clearing virus, CYVCV）的PCR引物组合，包含3条黄龙病病菌16s特异引物，具体信息为：
CLas 16s F118：TTGGAGAGAGATGAGCCTGCLas 16s R866：AAGGGCTGGTAAGGTTCTGCLas 16s R958：ACCCAACATCTCACGACAC3条柑桔黄化脉明病病毒外壳蛋白特异引物，具体信息为：CYVCV CP F41：CATTTCCACATTACTGCGAGCYVCV CP F163：AAACAACCACTTCACCCGCYVCV CP R488：TCTATGTTCAAGATGCGGAC2条柑桔通用内参基因CtACT特异引物，具体信息为：CtACT F460：GATCATATGGAGGTGCTATCACCtACT R580：TGAAGATGGTTCAGCAAGTAG一种利用上述引物组合同时检测柑桔黄龙病病原菌和黄化脉明病病毒的方法，包括如下步骤：（1）待测样品总RNA提取，反转录为cDNA。
[0008]（2）采用权利1所述引物组合，以待测样品cDNA为模板，以进行PCR反应，获得扩增产物。
[0009]（3）1%琼脂糖电泳检测1-6 μL扩增产物，若同时出现840 bp、748 bp、447 bp、325 bp或120 bp大小阳性条带，则表示样品cDNA可用且同时含有CLas和CYVCV；若出现840 bp、748 bp或120 bp大小阳性条带，则表示样品cDNA可用且含有CLas；若出现447 bp、325 bp或120 bp大小阳性条带，则表示样品cDNA可用且含有CYVCV；若仅出现120 bp，则表示样品cDNA可用，但未检测到CLas和CYVCV。所述PCR反应的体系为20 μL，包括：cDNA模板1 μL，10 μmol/L不同上、下游引物各1 μL，2 X Taq PCR Mix反应液10 μL，加dd H2O至总体积20 μL。所述PCR体系中引物可以以CLas16s特异性引物CLas 16s F118、CLas 16s R866、CLas 16s R958为组合检测柑桔CLas，CYVCV外壳蛋白特异引物CYVCV CP F41、CYVCV CP F163、CYVCV CP R488为组合检测柑桔CYVCV，内参引物CtACT F460、CtACT R580组合检测百香果cDNA质量；CLas 16s F118、CLas 16s R866、CLas 16s R958、CYVCV CP F41、CYVCV CP F163、CYVCV CP R488、CtACT F460、CtACT R580为组合同时检测柑桔CLas和CYVCV以及cDNA合成质量（图1）。以上引物组合可根据实际需要进行选择。
[0010]所述PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性20 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min，最终4℃保存。
[0011]本专利技术的优点在于：本专利技术从CLas和CYVCV编码基因序列保守区各设计3条CLas和CYVCV特异性引物组成4对引物组合，在提高针对柑桔CLas和CYVCV特异性检测的同时，可以产生对假阳性扩增产物的排除的作用（图1），增加设计1对柑桔内参CtACT引物可以检测cDNA合成质量，可以产生对假阴性扩增产物的排除的作用（图1）。本检测方法可检出柑桔CLas和CYVCV灵敏度相当于10-5 g病叶组织量（50 ng 病叶RNA），即在样品模板稀释1 0000倍后仍均可扩增出CLas、CYVCV以及CtACT特异性条带，在样品cDNA稀释10 0000倍后仍可扩增出CYVCV特异性条带（图2）。
附图说明
[0012]图13条CLas和3条CYVCV特异性引物各组成2对引物组合以及1对内参基因CtACT扩增效果。1-5分别为H2O为模板、含有CLas、含有CYVCV、同时含有CLas和CYVCV、内参CtACT，M为DNA Marker 2000。
[0013]图2cDNA从1-6分别为1倍到10 0000倍稀释液的扩增效果，M为DNA Marker 2000。
[0014]图3 待测柑桔叶片。3-A为健康柑桔叶片，3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种柑桔黄龙病病原菌(Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas)和黄化脉明病病毒（Citrus yellow vein clearing virus, CYVCV）的PCR引物组合，其特征在于，包含3条柑桔黄龙病病菌16s特异引物，具体信息为：CLas 16s F118：TTGGAGAGAGATGAGCCTG；CLas 16s R866：AAGGGCTGGTAAGGTTCTG；CLas 16s R958：ACCCAACATCTCACGACAC；3条柑桔黄化脉明病病毒外壳蛋白特异引物，具体信息为：CYVCV CP F41：CATTTCCACATTACTGCGAG；CYVCV CP F163：AAACAACCACTTCACCCG；CYVCV CP R488：TCTATGTTCAAGATGCGGAC；2条柑桔通用内参基因CtACT特异引物，具体信息为：CtACT F460：GATCATATGGAGGTGCTATCAC；CtACT R580：TGAAGATGGTTCAGCAAGTAG。2.一种利用权利要求1所述的引物组合同时检测柑桔黄龙病病原菌和黄化脉明病病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）待测样品总RNA提取，反转录为cDNA；（2）采用权利如权利要求1所述引物组合，以待测样品cDNA为模板，以进行PCR反应，获得扩增产物；（3）1%琼脂糖电泳检测1-6 μL扩增产物，若同时出现840 bp、748 bp、447 bp、325 bp或120 bp大小阳性条带，则表示样品cDNA可用且同时含有CLas和CYVCV；若出现840 bp、74...
【专利技术属性】
技术研发人员：王培育，叶炜，郑雄建，杨学，张春柳，
申请(专利权)人：三明市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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