一种用于检测鼠疫耶尔森菌的荧光PCR试剂及方法技术

本发明专利技术提供一种检测鼠疫耶尔森菌的荧光PCR试剂及方法。本发明专利技术提供的鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测试剂以鼠疫耶尔森菌染色体上的dam基因和pPCP1质粒上的pla基因作为检测靶标，对大部分菌株有较高的检测灵敏度，又确保个别菌株不会因pla基因缺失而被漏检。该试剂所用的引物、探针序列是基于最新的鼠疫耶尔森菌核酸序列信息设计筛选所得，具有良好的包容性、特异性和反应性能，能保证检测的准确性。优选地，本发明专利技术运用冷冻干燥技术将鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测试剂制成冻干型试剂，常温下稳定，无需冷链运输和保存，从而避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险，适应长途运输和冷链条件差的地区的使用需要，使用时直接加核酸样本即可上机检测。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测鼠疫耶尔森菌的荧光PCR试剂及方法
本专利技术涉及病原微生物检测技术，具体地说涉及鼠疫耶尔森菌的核酸检测。
技术介绍
鼠疫是我国传染病防治法规定的甲类传染病，其病原体为鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)。鼠疫依发病部位不同可分为腺鼠疫、败血型鼠疫、肺鼠疫、肠鼠疫、脑膜炎型鼠疫、眼鼠疫、皮肤鼠疫等，其中以腺鼠疫最常见。鼠疫的主要传播途径有：(1)蚤类叮咬。鼠疫的最主要传染源是啮齿类动物，鼠疫耶尔森菌可通过蚤类叮咬传染给人类和其他动物。人类鼠疫的首发病例多由寄生于家鼠的印鼠客蚤(Xenopsyllacheopis)叮咬所致。鼠疫耶尔森菌经皮肤进入人体，沿淋巴循环和血循环扩散，引起腺体坏死和败血症，即腺鼠疫和败血型鼠疫。(2)接触传播。鼠疫耶尔森菌可以通过伤口，包括如手指的倒刺等细小的伤口等进入人体，然后经淋巴管或血液引起腺鼠疫或败血型鼠疫。(3)飞沫传播。鼠疫患者呼吸道中的鼠疫耶尔森菌可经呼吸、咳嗽飞沫进行传播，吸入一定数量的鼠疫耶尔森菌后，可引起肺鼠疫。(4)食物传播。鼠疫耶尔森菌可通过食物，主要是未煮熟的鼠疫病死动物，感染消化道，引发肠鼠疫。对鼠疫的实验室检验除了血常规、尿常规、便常规、影像学、免疫学等之外，还离不开对鼠疫耶尔森菌的核酸检测。鼠疫耶尔森菌分类学属于变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科、耶尔森菌属、鼠疫耶尔森菌。鼠疫耶尔森菌也称“鼠疫杆菌”，呈革兰氏阴性、短小杆状。基因组由一条环状染色体(约4.65Mb)和3个质粒(pCD1、pPCP1、pMT1)组成，其中pPCP1和pMT1是鼠疫耶尔森菌特有的质粒。基于荧光PCR技术的核酸检测是鼠疫耶尔森菌检测的重要手段，需对患者淋巴结穿刺液、血液、痰液，咽部或眼分泌物、吐泻物、脑脊液、管状骨骨髓或其它脏器标本中检测鼠疫耶尔森菌。出于特异性和灵敏度的考虑，现有的鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测试剂多以pPCP1质粒上的编码plasminogenactivator的pla基因和pMT1质粒上编码F1capsuleantigen的caf1基因作为检测靶标。研究表明pPCP1质粒在鼠疫耶尔森菌细胞中有150-200个拷贝，但2％的鼠疫耶尔森菌不含pPCP1质粒；pMT1质粒在鼠疫耶尔森菌细胞中有两个拷贝，但也有2％的鼠疫耶尔森菌不含pMT1质粒。这意味着以pla基因和caf1基因为靶标检测鼠疫耶尔森菌存在一定的漏检风险。鼠疫的防疫和临床诊断需要一种更准确可靠，特别是能防止漏检风险的鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测试剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种更准确可靠的鼠疫耶尔森菌PCR检测试剂。本专利技术所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：1.引物、探针设计及反应体系建立本专利技术所述的鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测试剂以鼠疫耶尔森菌染色体上编码DNAadeninemethylase的dam基因和pPCP1质粒上的pla基因作为检测靶标。dam基因由于在染色体上，不容易丢失，在不同的菌株间具有良好的包容性；pla基因在质粒上，有丢失风险，但在大部分菌株中具有高达150-200个拷贝数。同时以dam基因和pla基因作为检测靶标既对大部分菌株有较高的检测灵敏度，又确保个别菌株不会由于pla基因缺失而漏检。本专利技术用于检测鼠疫耶尔森菌dam基因和pla基因引物探针分别基于GenBank数据库最新的鼠疫耶尔森菌核酸信息设计、筛选而得出，序列如下：检测dam基因的正向引物序列为5’-ATCCAGCCGAAAACCAGTTGT-3’，反向引物的序列为5’-GGCGCGGAAATTAGTCATCA-3’，探针的序列为5’-TCGCGCCAGCAGAACCAAATCC-3’。探针的5’端用荧光报告基团FAM修饰，荧光报告基团还可选用JOE、HEX、VIC、TET、ROX和CY5中的任意一种；3’端用荧光淬灭基团BHQ1修饰，荧光淬灭基团还可以选用BHQ2、BHQ3、TAMRA和Eclipse中的任意一种。该引物、探针的序列在已知鼠疫耶尔森菌核酸序列中高度保守，且对其它物种具有排他性。检测pla基因的正向引物的序列为5’-GTTAATACCAAATATATCCCCTGACAGC-3’，反向引物的序列为5’-TTCTTCCTGTTTCTGCGTCATAAAG-3’，探针的序列为5’-TACAGTTGCAGCCTCCA-3’。探针的5’端用荧光报告基团JOE修饰，荧光报告基团还可选用FAM、HEX、VIC、TET、ROX和CY5中的任意一种；3’端用MGB基团修饰。该引物、探针的序列在已知鼠疫耶尔森菌pla基因序列中高度保守，且对其它物种具有排他性。本专利技术的鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测试剂的反应体积为25μl，其成分组成如表1所示，可配成2x(即12.5μl/反应)的预混液保存于-20℃，使用时加水和待测核酸样本至25μl的反应体积即可上机检测。表1.鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测试剂成分成分单份含量单份优选含量200mMTris-HCl缓冲液(pH8.3)2.5μl2.5μl氯化钾0.5-3μmol1.55μmol氯化镁0.02-0.2μmol0.075μmoldNTPs3-8nmol5nmolTaqDNA聚合酶2U2Udam基因正向引物2-20pmol10pmoldam基因反向引物2-20pmol10pmoldam基因探针1-10pmol5pmolpla基因正向引物2-20pmol10pmolpla基因反向引物2-20pmol10pmolpla基因探针1-10pmol5pmol冻干赋形剂(仅用于试剂冻干)2.25mg2.25mg2.试剂冻干本专利技术所述的鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测试剂可以是常规的液体剂型，优选地，也可以通过冷冻干燥技术制成冻干型试剂。冻干所得的冻干型试剂的优点是：常温下稳定，无需冷链运输和保存，从而避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险。本专利技术提供的鼠疫耶尔森菌冻干型荧光PCR检测试剂按表1的成分冻干而成，可将1份或多份试剂冻干在容器中，优选地，可按1份/管冻干在可直接上机的PCR管或由PCR管组合成的多连管或反应板中。冻干所得的鼠疫耶尔森菌冻干型荧光PCR检测试剂为白色颗粒状，可在遮光、防潮条件下常温保存。单份试剂所含干物质的体积约相当于2μl，使用时直接加总体积为23μl的水和待测核酸样本即可配成25μl的反应体系，优选地，可直接加23μl适当浓度的核酸样本。试剂加水和核酸样本后经慢速震荡可加速溶解，溶解后即可上机本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测鼠疫耶尔森菌的荧光PCR试剂，含有Tris-HCl缓冲液、氯化钾、氯化镁、dNTPs、Taq DNA聚合酶，其特征在于，还含有下述用于检测鼠疫耶尔森菌dam基因和pla基因的引物探针组合：/n检测dam基因的正向引物序列为5’-ATCCAGCCGAAAACCAGTTGT-3’，反向引物的序列为5’-GGCGCGGAAATTAGTCATCA-3’，探针的序列为5’-TCGCGCCAGCAGAACCAAATCC-3’，所述的探针的5’端和3’端分别用荧光报告基团和荧光淬灭基团修饰；/n检测pla基因的正向引物的序列为5’-GTTAATACCAAATATATCCCCTGACAGC-3’，反向引物的序列为5’-TTCTTCCTGTTTCTGCGTCATAAAG-3’，探针的序列为5’-TACAGTTGCAGCCTCCA-3’，所述的探针的5’端和3’端分别用荧光报告基团和MGB基团修饰。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测鼠疫耶尔森菌的荧光PCR试剂，含有Tris-HCl缓冲液、氯化钾、氯化镁、dNTPs、TaqDNA聚合酶，其特征在于，还含有下述用于检测鼠疫耶尔森菌dam基因和pla基因的引物探针组合：
检测dam基因的正向引物序列为5’-ATCCAGCCGAAAACCAGTTGT-3’，反向引物的序列为5’-GGCGCGGAAATTAGTCATCA-3’，探针的序列为5’-TCGCGCCAGCAGAACCAAATCC-3’，所述的探针的5’端和3’端分别用荧光报告基团和荧光淬灭基团修饰；
检测pla基因的正向引物的序列为5’-GTTAATACCAAATATATCCCCTGACAGC-...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎绍基，林镜中，黄俊辉，朱碧莹，刘钰涵，
申请(专利权)人：深圳市赛格诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44